固相萃取-反相高效液相色譜法測定紅毛丹中抑霉唑的殘留動態

高智席，江忠遠，李新發，吳艷紅，牟青松，敖克厚，鄧傳躍

(1.遵義師范學院化學系，貴州 遵義 563002；2.西南大學化學化工學院，重慶 400715)

固相萃取-反相高效液相色譜法測定紅毛丹中抑霉唑的殘留動態

高智席1，江忠遠1，李新發1，吳艷紅1，牟青松1，敖克厚1，鄧傳躍2

(1.遵義師范學院化學系，貴州 遵義 563002；2.西南大學化學化工學院，重慶 400715)

建立固相萃取-反相高效液相色譜法測定紅毛丹中抑霉唑的殘留動態分析的方法。色譜柱為Shim-pack VPODS(150mm×4.6mm，5μm)，檢測波長229nm，流動相為甲醇-離子對溶液(75:25，V/V)，流速0.85mL/min，進樣量20μL。抑霉唑在15.0～960.0μg/L(r＝0.9994)范圍內與峰面積呈良好線性關系，檢出限為5μg/L，抑霉唑回收率為86.4%～104.5%，相對標準偏差0.84%～2.87%。同時，還對抑霉唑由紅毛丹皮向肉的遷移，在紅毛丹體上的降解動態進行分析。該方法操作簡便快速，可作為紅毛丹中抑霉唑含量監測的方法。

抑霉唑；固相萃取；反相高效液相色譜；紅毛丹

抑霉唑[烯丙基1-(2,4-二氯苯基)-2-咪唑-1-基乙基醚]是近年來開發的一種結構新穎、作用機制獨特、高效、低毒和廣譜的嘧啶胺類內吸性殺菌劑，并具有預防和治療作用。對侵襲谷物、水果和蔬菜的病原體——交鏈孢菌、寄生霜霉、灰霉枝孢和霉根霉等具有良好的抑殺作用[1]。

紅毛丹是一種極具經濟價值的熱帶水果，外觀美、營養豐富、富含碳水化合物、各種維生素和礦物質。長期食用可潤膚養顏、清熱解毒、增強人體免疫力。但紅毛丹在我國只有海南等少數地區分布，主要依賴東南亞進口，儲存運輸的周期比較長，保鮮能力又比較差。因此，抑霉唑常被應用于紅毛丹收獲前和收獲后的生產、儲存及保鮮過程中。

通常測定抑霉唑的方法有高效液相色譜法[2-5]、氣相色譜法[6-12]，氣相色譜-質譜聯用法[13-15]等。但關于紅毛丹中抑霉唑殘留動態分析的高效液相色譜測定方法未見報道。本實驗擬建立固相萃取反相高效液相色譜分離，二極管陣列檢測器測定紅毛丹中抑霉唑殘留動態分析的方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

紅毛丹(市售)，0～5℃冷藏。

抑霉唑標準品(含量≥99%) 國家標準物質標準樣品信息中心；無水硫酸鈉(AR，130℃烘2h，貯于干燥器中備用)、甲醇(分析純)、磷酸(95%，分析純)、正己烷(分析純)、乙酸乙酯(分析純)、磷酸二氫鈉(99%，分析純)；二次蒸餾水。

所有溶液使用前均由0.45μm孔徑的濾膜過濾。離子對溶液：稱4.45g Na2H2PO4·2H2O溶于1000mL二次蒸餾水中，滴加質量分數85%磷酸調至pH≈2.5，搖勻，超聲振蕩15min，用0.45μm的孔徑濾膜過濾，備用。

LC-2010AT型高效液相色譜儀(LCsolution色譜工作站，CBM-20A系統控制器，SPD-M20A二極管陣列檢測器，SIL-20A自動進樣器) 日本Shimadzu公司；SY3200超聲波清洗器 上海聲源超聲波儀器設備有限公司；EYELAN-1型旋轉蒸發儀 德國Heidoph公司；電子天平 上海越平科學儀器有限公司；DS-1高速組織搗碎機 上海標本模型廠；THZ-82A型振蕩機 江蘇富華儀器有限公司；DHG-9070A型新型電熱恒溫鼓風干燥箱寧波江南儀器廠；混合陽離子固相萃取柱(PCX，HRXC，60mg，3mL)、24DL固相萃取裝置 Visiprep公司；微孔過濾裝置。

1.2 色譜條件

色譜柱：Shim-pack VP-ODS(150mm× 4.6mm，5μm)；流動相：甲醇:離子對溶液=75:25(V:V)(pH≈2.5)；紫外檢測波長：229nm；流速：0.85mL/min；柱溫：室溫；進樣量：20μL。

1.3 樣品前處理及測定

1.3.1 標準溶液的配制

準確稱取抑霉唑標準品0.0401g(精確至0.0001g)，置于50mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻后即為質量濃度802μg/mL抑霉唑的儲備液。用移液管準確移取不同體積的抑霉唑標準溶液分別置于25mL容量瓶中，再用甲醇定容得一系列不同濃度的抑霉唑標準溶液，搖勻并貼上標簽，保存(0～10℃)，備用。

1.3.2 樣品前處理

樣品紅毛丹在802μg/mL抑霉唑溶液中蘸浸后取出，然后在間隔不同的時間將紅毛丹皮削下，將紅毛丹皮和紅毛丹肉分別編號并保存，樣品保存在冷藏柜里(0～5℃)。不同編號的樣品依次進行殘留量測定。

將未經清洗的紅毛丹肉與紅毛丹皮經組織搗碎機搗碎，各稱取其5.00g(精確到0.01g)置于帶蓋塑料離心管中，準確加入30mL乙酸乙酯-環己烷(1:1，V/V)和2g氯化鈉，在渦旋混合器上渦旋1min，超聲振蕩20min，在10000r/min離心機上離心10min，取上清液凈化。

分別用3mL甲醇，3mL水活化混合型陽離子交換固相萃取柱，準確移取3mL(具體由樣品含量高低來確定)離心上清液分別上PCX固相萃取柱，過柱速度1mL/min以內。再用3mL水和3mL甲醇洗滌混合型陽離子交換固相萃取柱[16]，抽近干后用氨水甲醇溶液5mL洗脫。在40℃條件下用氮氣吹干，準確加入1.00mL甲醇溶液，渦旋振蕩1min，過0.45μm濾膜，待測定。

2 結果與分析

2.1 檢測波長的選擇

利用二極管陣列檢測器在線掃描配制好的抑霉唑標準溶液，可得到抑霉唑的吸收波長響應值的紫外吸收圖譜，最大吸光度出現在229nm處，產品中各雜質在該波長時對產品的測定無影響，且色譜峰形較好。因此，選擇229nm作為本方法的最適檢測波長。

2.2 流動相的選擇

分別以乙腈:離子對溶液和甲醇:離子對水溶液體系作流動相進行比較，發現甲醇:離子對溶液作流動相時，抑霉唑與其雜質分離完全且峰形對稱；再經過比較不同配比的甲醇:離子對水溶液體系[4]，發現甲醇-離子對溶液(75:25，V:V)，柱效最高，保留時間適宜。

2.3 流速選擇

在優化流動相和檢測波長條件下，以0.30～1.30mL/min的不同流速進行測定，分析比較發現在0.85mL/min流速下的抑霉唑液相色譜峰形較好、出峰時間較早，故選擇0.85mL/min為檢測流速。

2.4 線性范圍及檢出限

按照上述色譜條件，以質量濃度為橫標，峰面積為縱坐標制作抑霉唑標準曲線，經過回歸，得到其線性方程為Y＝15.502X－290.38，r＝0.9994。線性范圍為15～960.0μg/L。抑霉唑標準譜圖見圖1，標準出峰在2.1765min。用標準工作曲線的最低濃度點，按上述色譜條件測定6次，得一組低濃度標準峰面積，求出其標準偏差，以3倍標準偏差除以方法的靈敏度，即得方法的檢出限為5μg/L。抑霉唑標樣色譜圖和樣品色譜圖見圖1所示。

圖1 標準品(A)和紅毛丹肉(B)中抑霉唑的色譜圖Fig.1 Chromatogram of imazalil standard and imazalil in rambutan flesh

2.5 方法的精密度和回收率

在選定的色譜條件下進行添加回收實驗，紅毛丹肉分別以0.01、0.05、0.1mg/kg 3個添加水平，紅毛丹皮分別以0.05、0.1、0.2mg/kg 3個添加水平，按照樣品處理方法進行提取凈化，測定抑霉唑含量，計算回收率見表1。紅毛丹肉抑霉唑添加回收率在86.4%～102.3%，RSD(n=3)為1.5%～2.87%，紅毛丹皮抑霉唑添加回收率在88.9%～104.5%，RSD(n=3)為0.84%～1.46%，方法的回收率和標準偏差達到滿意結果。在選定的色譜條件下，質量濃度40μg/mL的標準品連續測定5次，保留時間和峰面積的RSD分別為0.15%和2.68%(n=5)。因此，本方法具有很高的靈敏度與精密度，重復性好，回收率穩定，可以為紅毛丹樣品中抑霉唑的測定提供參考方法。運用本實驗建立的方法對實驗所得的上百個紅毛丹樣品進行測定，數據穩定可靠。

表1 回收率及精密度(n=3)Table 1 Recovery rates and RSDs of imazalil in rambutan peel and flesh (n=3)

2.6 樣品測定

對樣品中紅毛丹肉和紅毛丹皮中的抑霉唑含量進行測定，紅毛丹肉中含量2.36mg/kg，紅毛丹皮中含量21.34mg/kg。

2.7 紅毛丹中抑霉唑的降解曲線

從圖2可以看出，在30d內，在紅毛丹肉中抑霉唑殘留量隨貯藏時間的推移，呈增加的趨勢，而在紅毛丹皮中呈下降趨勢，表明抑霉唑在不斷地從紅毛丹皮中轉移到紅毛丹肉中。第60天(最后一次分析)，抑霉唑殘留量在紅毛丹肉和紅毛丹皮中明顯降低。說明紅毛丹中殘留的抑霉唑隨著貯藏時間的延長逐漸降解。

圖2 抑霉唑在紅毛丹中的殘留動態曲線Fig.2 Residue dynamic curves of imazalil in rambutan

3 結 論

本實驗建立紅毛丹中抑霉唑的固相萃取-反相高效液相色譜殘留動態分析的方法。該方法簡單快速，精密度與靈敏度較高，是一種有效檢測水果采后的儲存過程中抑霉唑含量的有效方法。

[1] 甘伯中, 張文利, 汪建旭, 等. 塑料薄膜包裝花椰菜采后病害癥狀、病原及防治藥物篩選[J]. 甘肅農業大學學報, 1998, 33(1): 79-82.

[2] 付新梅, 張麗靜, 封順, 等. 高效液相色譜法同時測定甜瓜樣品中的抑酶唑和噻菌靈[J]. 分析化學, 2004, 32(3): 329-331.

[3] 楊濤, 艾爾肯·不拉音, 靳智, 等. 反相高效液相色譜法同時測定果蔬中6種防腐殺菌劑[J]. 食品科技, 2008, 33(9): 245-247.

[4] 郭治安, 趙景嬋, 王耀, 等. 殺菌劑中抑霉唑含量的離子對高效液相色分析[J]. 分析化學, 2004, 32(2): 217-220.

[5] FEMANDEZ M, RODRIGUEZ R, PIEO Y, et al. Liquid chromatographic-mass spectrometric determination of post-harvest fungicides in citrus fruits[J]. J Chromatog A, 2001, 912(2): 301-310.

[6] NAVICKIENE S, M L RIBEIRO M L. A simplified method for the gas chromatographic determination of pyrimethanil residues in fruits[J]. J Sep Sci, 2001, 24(6): 470-472.

[7] 潘守奇, 孫軍, 董靜, 等. 氣相色譜法測定水果和蔬菜中異丙威、嘧霉胺、抑霉唑殘留量[J].食品科學, 2008, 29(12): 516-518.

[8] 應興華, 徐霞, 閔捷, 等. 離心破乳-氣相色譜法測定黑米中殘留抑酶唑的研究[J]. 分析試驗室, 2009, 28(9): 59-61.

[9] 應興華, 徐霞, 陳銘學, 等. 糧谷中抑酶唑殘留的氣相色譜法測定[J].分析測試學報, 2009, 28(4): 398-402.

[10] NAVICKIENE S, RIBEIROM L. A simple and rapid extraction for gas chromatographic determination of thiabendazole and imazalil residues in lemons[J]. J Braz Chem Soc, 2002, 13(5): 592-596.

[11] 趙其陽, 焦必寧, 王成秋, 等. 氣相色譜法同時測定柑桔中抑霉唑、噻菌靈和嘧霉胺殘留[J]. 現代科學儀器, 2007(1): 77-79.

[12] 武婷, 劉波, 李楠. 殺菌劑抑霉唑在梨子中殘留動態分析[J]. 分析試驗室, 2007, 26(9): 81-83.

[13] 靳智, 楊濤, 李明, 等. 氣相色譜質譜聯用法同時測定果蔬中5種防腐殺菌劑[J]. 分析試驗室, 2008, 27(增刊2): 73-75.

[14] NAVALQN A, PRIETO A, ARAUJO L, et al. Determination of pyrimethanil and kresoximmethyl in green groceries by headspace solidphase microex traction and gas chromatography-mass spectrometry[J]. J Chromatogr A, 2002, 975(2): 355-360.

[15] CHARLTON A J, JONES A. Determination of imidazole and triazole fungicide residues in honeybees using gas chromatography-mass spectrometry[J]. J Chromatogr A, 2007, 1141(1): 117-122.

[16] 吳彩梅, 白潔, 賈剛, 等. 高效液相色譜法測定雞蛋中的三聚氰胺[J].食品科學, 2011, 32(8): 212-218.

Residue Dynamic Analysis of Imazalil in Rambutan by RP-HPLC with Solid-Phase Extraction

GAO Zhi-xi1，JIANG Zhong-yuan1，LI Xin-fa1，WU Yan-hong1，MU Qing-song1，AO Ke-hou1，DENG Chuan-yue2
(1. Department of Chemistry, Zunyi Normal College, Zunyi 563002, China；
2. School of Chemistry and Chemical Engineering, Southwest University, Chongqing 400715, China)

A reversed-phase high performance liquid chromatographic method with solid-phase extraction was proposed for the residue dynamic analysis of imazalil in rambutan. The analyte was separated on a Shim-pack VP-ODS (150 mm × 4.6 mm,5 μm) using a mobile phased composed of a mixture at a volume ratio of 75:25 of methanol and acidic Na2H2PO4 solution approximately at pH 5 (adjusted with 85% phosphoric acid) at a flow rate of 0.85 mL/min, and detected at 229 nm. The injection amount was 20 μL. An excellent linearity of imazalil in the range of 15.0－960.0 μg/L was achieved (r ＝0.9994). The detection limit was 5.0 μg/L. The average spike recovery rates were in the range of 86.4%－104.5% with relative standard deviation of 0.84%－2.87%. The method was fast, simple, and applicable for the determination of imazalil residue in rambutan.

imazalil；solid-phase extraction；RP-HPLC；rambutan

O657.72

A

1002-6630(2012)08-0188-03

2011-05-30

貴州省遵義市科技局項目([2008]26號)；貴州省教育廳自然科學基金項目([2010]085號)

高智席(1969—)，男，副教授，碩士，研究方向為儀器分析。E-mail：wyhgzx@163.com