離子色譜法測定奶粉中的葡萄糖、蔗糖和乳糖

熊建飛，周光明*，許 麗，張 磊

(發光與實時分析教育部重點實驗室，西南大學化學化工學院，重慶 400715)

離子色譜法測定奶粉中的葡萄糖、蔗糖和乳糖

熊建飛，周光明*，許 麗，張 磊

(發光與實時分析教育部重點實驗室，西南大學化學化工學院，重慶 400715)

建立高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測法測定奶粉中葡萄糖、蔗糖和乳糖的方法。以METROSEP CARB 1(150mm×4.0mm)陰離子交換柱為分離柱，脈沖安培檢測，37mmol/L NaOH溶液為淋洗液，以檸檬酸作為蛋白質沉淀劑。葡萄糖、蔗糖和乳糖的線性范圍分別為1～40、1～50、1～50mg/L，相關系數分別0.9966、0.9968、0.9985，檢出限分別為0.014、0.091、0.083mg/L，精密度為1.10%～4.96%，回收率為90.13%～104.83%。該方法分析時間短，前處理簡單，適用于快速測定奶粉中的葡萄糖、蔗糖和乳糖。

高效陰離子交換色譜；脈沖安培檢測；奶粉；葡萄糖；蔗糖；乳糖；檸檬酸

奶粉中含有多種營養成分，如蛋白質、脂肪、糖類、維生素、礦物質等，其中糖類是一種比較重要的物質。如乳糖是奶粉中含量較高的一種糖，經乳糖酶作用后形成有機酸，可以促進鈣離子的吸收，另外乳糖還能夠促進有益菌的成長，有利于腸道健康。但是有些人體內缺乏乳糖酶，使乳糖消化和吸收受到阻礙，即所謂的乳糖不耐受[1]。乳糖不耐受者食用過量乳糖后會出現腹瀉、腹痛等癥狀。蔗糖是常用的食品添加劑之一，常被加入奶粉中以提高含糖量。食用過量蔗糖會危害身體健康，如蛀牙、肥胖等。因此測定奶粉中的糖對于控制奶粉質量和指導消費者具有重要意義。

目前，測定糖的方法主要有高效液相色譜法[2-3]、氣相色譜法[4]、毛細管電泳色譜法[5]等，這些方法大多存在衍生化處理或靈敏度低等缺陷。高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測法是近年來發展起來的一種測定糖的有效方法，靈敏度高，樣品前處理簡單，可直接分離測定單糖、二糖和小分子寡糖[6]。糖類化合物具有弱酸性，在堿性環境中能夠解離成陰離子，可根據其解離常數的不同進行分離。在強堿性(pH＞12)環境中糖類化合物可在電極上發生氧化反應，從而引起電流變化，因此可用脈沖安培檢測器進行檢測[7]。該法通常以NaOH溶液為流動相，為糖的解離和檢測提供了一個堿性環境。離子色譜法測定糖已有較多報道，如測定蜂蜜和葡萄酒中的糖[8]、測定蜂蜜和蜂膠中的糖[9]、測定茶葉中的糖[10]等，但是用離子色譜法同時測定奶粉中葡萄糖、蔗糖和乳糖還未見有文獻報道。

奶粉中含有較多的蛋白質，目前蛋白質的沉淀劑多為乙酸、乙酸鋅、三氯乙酸、草酸鈉-磷酸氫二鈉混合液等[11-15]。乙酸具有揮發性，乙酸鋅在堿性環境中生成沉淀，三氯乙酸具有毒性，草酸鈉-磷酸氫二鈉配制較為繁瑣。而本實驗擬采用檸檬酸作為沉淀劑，沉淀快速完全，操作簡單，并且檸檬酸不具有揮發性和毒性，優化處理條件，擬建立高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測法測定奶粉中葡萄糖、蔗糖和乳糖的方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

學生奶粉(碳水化合物≤56%)、老年奶粉(碳水化合物≤55%)、全脂甜奶粉(加蔗糖17g/100g)、全脂奶粉(低糖) 市售。

葡萄糖(分析純)、蔗糖(生化試劑)、琥珀酸(分析純)成都市科龍化工有限公司； 乳糖(分析純) 寧波大川精細化工有限公司；檸檬酸(分析純) 成都化學試劑廠；NaOH(分析純) 重慶川東化工有限公司。實驗用水：去離子水(電阻率≥18.2MΩ·cm)。

861型離子色譜儀、METROSEP CARB 1(150mm×4.0mm)陰離子交換柱、817脈沖安培檢測器、IC-Net 2.3色譜工作站 瑞士萬通公司；FA2004A電子天平 上海精天電子儀器有限公司；GM-0.33II隔膜真空泵 天津市騰達過濾器件廠；CQ50超聲波清洗器 上海必能信超聲波有限公司；布氏漏斗、0.45μm微孔濾膜。

1.2 色譜條件

分離柱：METROSEP CARB 1(150mm×4.0mm)陰離子交換柱；檢測器：脈沖安培檢測器；淋洗液：37mmol/L NaOH溶液；柱溫：32℃；流速：1.0mL/min；再生液：200mmol/L NaOH溶液；峰面積定量。

1.3 標準溶液和淋洗液的配制

標準溶液的配制：分別精密稱取葡萄糖、蔗糖、乳糖、檸檬酸、琥珀酸0.1000g，放入100mL容量瓶中，加入20mL去離子水，攪拌溶解置入100mL容量瓶中定容至刻度，配成1000mg/L標準溶液。

淋洗液的配制：稱取8.00g NaOH固體于100mL容量瓶中溶解轉入1000mL容量瓶中定容，配成200mmol/L的NaOH溶液作為再生液。同樣的方法分別稱取1.00、1.20、1.40、1.48、1.60、1.80、2.00g NaOH 固體配制成25、30、35、37、40、45、50mmol/L的NaOH溶液作為淋洗液。

1.4 沉淀劑的選擇與樣品前處理

沉淀劑的選擇：分別選用檸檬酸和琥珀酸來沉淀奶粉中的蛋白質，實驗發現，在加入相同量的檸檬酸和琥珀酸時，蛋白質都能夠沉淀，但是檸檬酸使蛋白質沉淀速度快而且沉淀顆粒大，而用琥珀酸作沉淀劑時，沉淀顆粒較小且沉淀速度稍慢。放置10min后，以檸檬酸作為沉淀劑的奶粉上清液比琥珀酸清澈。故本實驗采用檸檬酸作為蛋白質沉淀劑。

樣品前處理：精密稱取0.1000g奶粉，放入50mL小燒杯中，加入10mL去離子水，攪拌均勻后超聲15min，加入6mL 1000mg/L檸檬酸，緩慢攪拌，放置2h，用布氏漏斗過濾，0.45μm微孔濾膜過濾，在濾液中加入NaOH溶液使pH10，再用0.45μm微膜濾紙過濾，定容至100mL，取濾液8mL于100mL容量瓶中定容，進樣。

加入NaOH溶液的目的是使樣品中的Ca2+、Mg2+、Fe3+等轉化為沉淀以免樣品進入色譜柱后在堿性環境中生成沉淀而損害色譜柱。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 淋洗液濃度的選擇

實驗分別考察NaOH溶液濃度對分離度的影響，從圖1可以看到，隨著淋洗液濃度的增大，葡萄糖和乳糖的保留時間逐漸縮短，蔗糖的保留時間總體上也趨于縮短。當NaOH溶液的濃度低于30mmoL/L時，葡萄糖和蔗糖峰有部分重疊，隨著淋洗液濃度的增大，二者的分離度逐漸變好，大于45mmoL/L時蔗糖與乳糖分離度變差。因此本實驗選擇37mmoL/L NaOH溶液為淋洗液。標準圖譜如2圖所示。

圖1 淋洗液濃度對保留時間的影響Fig.1 Effect of eluent concentration on retention time

圖2 標準品色譜圖Fig.2 Chromatogram of a mixture of glucose, sucrose and lactose standards

2.1.2 柱溫的選擇

分別設定柱溫為20、25、32、35、40℃，結果表明，降低溫度，峰的分離度稍有改變，峰底變寬，而且柱壓逐漸增大，隨著溫度的升高分離度變差，綜合考慮選擇柱溫為32℃。

2.1.3 流速的選擇

分別設定流速為0.5、0.8、1.0、1.2、1.6mL/min，結果表明改變流速對分離度的影響很小，隨著流速的增大保留時間縮短，但柱壓升高，為了保護色譜柱和縮短分離時間，選擇1.0mL/min為流速。

2.2 標準曲線和儀器檢出限

分別從1000mg/L標準溶液中吸取0.2、0.6、1.0、2.0、4.0、6.0mL葡萄糖、蔗糖、乳糖于100mL容量瓶中定容配成混合標準溶液。分別測定混合標準溶液，繪制標準曲線，根據RSN＝3計算儀器檢出限，結果如表1所示，葡萄糖、蔗糖和乳糖的線性范圍分別為1～40、1～50、1～50mg/L，相關系數分別0.9966、0.9968、0.9985，檢出限分別為0.014、0.091、0.083mg/L；標準譜圖如圖2所示。由表1可知，所繪制的標準曲線沒有過坐標原點，說明存在基質效應，即在所測定的溶液中其他物質對被分析物產生的影響和干擾。由2.3節回收率測定結果可知，在本實驗條件下，基質效應對樣品中物質含量的準確測定影響不大。

表1 線性范圍與檢出限Table 1 Linear regression equations, linear ranges and detection limits

2.3 精密度和加標回收率

2.3.1 相對標準偏差

按照1.2節色譜條件和1.4節樣品處理方法，對樣品進行5次測定做精密度實驗，按峰面積計算相對標準偏差(RSD)，測定結果如表2所示，精密度在1.10%～4.96%之間。

表2 精密度測定結果Table 2 Results of precision tests

2.3.2 回收率

測出本底值后，分別稱取與測本底值時質量相同的奶粉樣品(精確到0.001g)：學生奶粉0.1031g、老年奶粉0.1016g、全脂甜奶粉0.1012g、全脂奶粉0.1010g，在其中加入標準物質，采用1.4節樣品處理方法進行樣品前處理，進樣測定，計算回收率如表3所示，回收率在90.13%～104.83%之間。

表3 加標回收率結果Table 3 Results of spike recovery tests

2.4 樣品測定結果

圖3 學生奶粉(A)和老年奶粉(B)樣品色譜圖Fig.3 Chromatograms of commercial milk powders

樣品色譜圖如圖3、4所示，測定結果如表4所示。由表4可知，學生奶粉、老年奶粉、全脂甜奶粉都含有葡萄糖、蔗糖和乳糖，其中葡萄糖含量較低，乳糖含量最高，而全脂奶粉只檢測到乳糖。

表4 樣品測定結果Table 4 The results of the samples

3 結 論

實驗表明，奶粉中主要含有3種糖：葡萄糖、蔗糖和乳糖。其中乳糖含量最高；葡萄糖含量最低；蔗糖在不同的奶粉中含量差別很大。不同的消費者應根據含糖量的不同來選擇適宜的奶粉。學生奶粉、老年奶粉和全脂奶粉測定結果與說明書上糖(碳水化合物包括糖類、淀粉、纖維素等)的含量基本相符，而全脂甜奶粉中蔗糖含量檢測值為22.27%，高于說明書上的蔗糖添加量(17%)。本實驗操作簡單，適用于快速測定奶粉中的糖類，為控制奶粉質量提供了一種簡便而有效的方法。

[1] 趙顯峰, 蔭士安. 乳糖不耐受以及解決方法的研究動態[J]. 中國學校衛生, 2007, 28(12): 1151-1153.

[2] FILSON P B, DAWSON-ANDOH B E. Characterization of sugars from model and enzyme-mediated pulp hydrolyzates using high-performance liquid chromatography coupled to evaporative light scattering detection[J]. Bioresource Technology, 2009, 100(24): 6661-6664.

[3] OUCHEMOUKH S, SCHWEITZER P, BEY M B, et al. HPLC sugar profiles of Algerian honeys[J]. Food Chemistry, 2010, 121(2): 561-568.

[4] ZHANG Wei, HE Hongbo, ZHANG Xudong. Determination of neutral sugars in soil by capillary gas chromatography after derivatization to aldononitrile acetates[J]. Soil Biology & Biochemistry, 2007, 39(10):2665-2669.

[5] CAMPA C, BAIUTTI E, FLAMIGNI A. Capillary electrophoresis of sugar acids[J]. Methods in Molecular Biology, 2008, 384(1): 307-355.

[6] 黃曉書, 徐鵬, 李衛華, 等. 高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測法分析蜜棗中的糖類化合物[C]//第十二屆全國離子色譜學術報告會論文集, 2008: 440-443.

[7] 丁明玉, 田松柏. 離子色譜原理與應用[M]. 北京: 清華大學出版社,2000: 73-75.

[8] 余娜, 周光明, 朱娟. 離子色譜法檢測蜂蜜和葡萄酒中的蔗糖、葡萄糖和果糖[J]. 食品科學, 2010, 31(16): 188-191.

[9] QIAN Weiliang, KHAN Z, WATSON D G, et al. Analysis of sugars in bee pollen and propolis by ligand exchange hromatography in combination with pulsed amperometric detection and mass spectrometry[J].Journal of Food Composition and Analysis, 2008, 21(1): 78-83.

[10] 劉婷, 周光明. 多糖的提取和分析方法[J]. 化工時刊, 2008, 22(3):66-70.

[11] 高新蕾, 吳莉. 奶粉中糖分的快速測定法[J]. 食品科技, 2004(4): 81-82.

[12] 呂岱竹. 離子色譜法測定豆奶粉中硝酸鹽, 亞硝酸鹽含量[J]. 食品科學, 2010, 31(10): 272-274.

[13] 劉玉峰, 李黎, 李東, 等. 高效液相色譜法測定食品中的單糖、雙糖[J]. 食品科學, 2007, 28(3): 293-295.

[14] 葉明立, 潘廣文, 胡忠陽, 等. 離子色譜法測定嬰幼兒奶粉中的核苷酸[J]. 色譜, 2010, 28(9): 898-901.

[15] 吳惠勤, 黃芳, 林曉珊, 等. 氣相色譜-質譜法測定奶粉及奶制品中的三聚氰胺[J]. 分析測試學報, 2008, 27(10): 1044-1048.

Determination of Glucose, Sucrose and Lactose in Milk Powder by Ion Chromatography

XIONG Jian-fei，ZHOU Guang-ming*，XU Li，ZHANG Lei
(Key Laboratory on Luminescence and Real-time Analysis (Southwest University), Ministry of Education,School of Chemistry and Chemical Engineering, Southwest University, Chongqing 400715, China)

A high performance anion exchange chromatographic-pulse amperometric detection method was established to determine glucose, sucrose and lactose in milk powder. The separation column used was METROSEP CARB 1 (150 mm ×4.0 mm) anion exchange column, and the mobile phase was 37 mmol/L NaOH. Citric acid was used to precipitate proteins from milk. The linear ranges of glucose, sucrose and lactose were 1－40, 1－50 mg/L and 1－50 mg/L with correlation coefficients of 0.9966, 0.9968 and 0.9985, respectively, and the detection limits were 0.014, 0.091 mg/L and 0.083 mg/L. The precision relative standard deviations of precision for 5 replicate determinations were in the range of 1.10%－4.96%. The recovery rates for glucose, sucrose and lactose in 4 different commercial samples were 90.13%－104.83%. The method was suitable for rapid determination of glucose, sucrose and lactose in milk powder, thanks to its short analysis time and simple pretreatment.

high performance anion exchange chromatography；pulsed amperometric detection；milk powder；sugar；citric acid

O657.75

A

1002-6630(2012)08-0176-04

2011-04-17

重慶市自然科學基金項目(CSTC，2007BB5370)；國家科技部重大專項(2008ZX07315)

熊建飛(1984—)，男，碩士研究生，研究方向為離子色譜。E-mail：feifei8487@163.com

*通信作者：周光明(1964—)，男，教授，博士后，研究方向為色譜與聯用技術。E-mail：gmzhou@swu.edu.cn