響應面優化超聲波輔助提取發芽糙米黃酮工藝

劉振春，張利寬，于 暢，馮建國

(吉林農業大學食品與科學工程學院，吉林 長春 130118)

響應面優化超聲波輔助提取發芽糙米黃酮工藝

劉振春，張利寬，于 暢，馮建國

(吉林農業大學食品與科學工程學院，吉林 長春 130118)

以體積分數50%的乙醇溶液為提取溶劑，采用超聲技術從發芽糙米中提取黃酮類化合物。采用Box-Behnken響應面設計法建立影響因素的二次回歸模型。通過響應面分析得到超聲波輔助提取發芽糙米黃酮的最佳提取條件為超聲時間11.7min、浸提溫度45.8℃、浸提時間30.5min、液料比18.9:1(mL/g)，發芽糙米黃酮的提取量可達(0.743±0.011)mg/g(n＝5)，達到理論值0.754mg/g的98.5%。該回歸模型模擬度良好，可以作為發芽糙米黃酮提取量測定的理論依據。

發芽糙米；黃酮；超聲波；響應面

我國稻谷年產量約2億噸，占全國糧食總產量的2/5，占世界稻谷產量的1/3，世界上有近一半的人以稻谷為主食[1]。隨著對發芽糙米中主要活性成分[2]及生理功能[3]的研究發現糙米的營養價值是精米難以媲美的。因此糙米及其活性成分的研究具有極大的開發潛力。

發芽糙米是指優質糙米在一定的溫度條件下浸泡之后控制其發芽，并使其發芽長度保持在0.5～1mm的濕制品或干制品。糙米的發芽過程實質[4]是糙米中所含有的大量酶被激活和釋放，并從結合態轉化為游離態的生化過程。正是由于這一生理過程，發芽后的糙米糠層纖維被軟化[5]，從而改善了糙米的蒸煮性、口感和消化性[6-7]；糙米發芽之后產生了很多功能性成分，如可溶性糖、多肽、GABA、阿魏酸、谷胱甘肽、角鯊烯、肌醇、肌醇六磷酸等[8-10]。與糙米相比，發芽糙米的生理活性[11-12]具有明顯的優勢。本實驗采用Box-Behnken響應面設計法對超聲波輔助提取發芽糙米提取黃酮工藝進行優化，以期為發芽糙米中黃酮提取工藝提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

市購糙米，經發芽[13]干燥、微粉碎后備用。

無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等均為分析純；蘆丁(標品級) 天津一方科技有限公司。

1.2 儀器與設備

FDV DUTPUT-2HP型原泰奇氣引式超微粉碎機 日本佑琦有限公司；JY99-2D超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司；SHA-B水浴恒溫振蕩器 金壇市醫療器械廠；FA1004A電子天平 上海精天電子儀器有限公司；LXJ-ⅡB離心機 上海安亭科學儀器廠；UV mini-1240型紫外-可見分光光度計 日本島津公司.。

1.3 方法

1.3.1 發芽糙米黃酮的超聲波輔助提取工藝流程

1.3.2 標準曲線方程的建立[14]

精確稱取0.020g蘆丁標品，用體積分數50%乙醇溶液溶解，溶液定容至100mL，配制成0.2mg/mL蘆丁標準液。分別吸取0.2mg/mL蘆丁標準溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL置于6個25mL容量瓶中，依次編號0～5；各加5% NaNO2溶液0.4mL，搖勻，放置6min；然后各加10% Al(NO3)3溶液0.4mL，搖勻，放置6min；然后再各加1mol/L NaOH溶液4mL，最后用50%乙醇溶液定容至刻度線，搖勻，放置15min，于波長510nm處測定吸光度，回歸方程為：

式中：A為吸光度；C為蘆丁質量濃度/(mg/mL)。

1.3.3 樣品中黃酮類化合物的測定

將發芽糙米用微粉碎機粉碎，過100目篩。準確稱取2g樣品置于100mL小燒杯中，按照一定的料液比加入提取溶劑，將燒杯放入水浴恒溫振蕩器中恒溫振蕩浸提，然后5000r/min離心10min，取2mL上清液于25mL容量瓶中，按照NaNO2-Al(NO3)3法測定吸光度，然后按照下式計算出發芽糙米黃酮提取量(以蘆丁計)[15]。

式中：Y為黃酮提取量/(mg/g)；A為吸光度；V為二次離心之后的上清液體積/mL；m為樣品質量/g。

1.3.4 數據分析

使用Design-Export 7.0.0對數據進行響應面分析及模型擬合。

2 結果與分析

2.1 超聲時間對發芽糙米黃酮提取的影響

在發芽糙米黃酮提取過程中，超聲波處理對物料的破壁作用明顯，對黃酮的提取率有影響，因此將超聲時間作為單因素來考察。以體積分數50%乙醇溶液為提取溶劑，取液料比為20:1(mL/g)，分別考察超聲時間為6、9、12、15、18min的條件下的發芽糙米黃酮提取量，結果見圖1。

圖1 超聲時間對黃酮提取量的影響Fig.1 Effect of ultrasound treatment time on extraction rate of flavonoids

由圖1可知，發芽糙米黃酮的提取量隨著超聲時間的增加而增加，但12min后隨著超聲時間的延長而降低，可能是超聲對黃酮的破壞或者其他的因素引起的，因此選取超聲處理12min較為合適。

2.2 浸提溫度對發芽糙米黃酮提取的影響

以體積分數50%的乙醇溶液為提取溶劑，取液料比為20:1，超聲處理12min后分別在25、35、45、55、65℃條件下提取30min，結果如圖2所示。

圖2 浸提溫度對黃酮提取量的影響Fig.2 Effect of temperature on extraction rate of flavonoids

由圖2可知，隨著溫度的升高，黃酮提取量顯著增加，但是45℃后增加趨于平緩略有下降，考慮到高溫可能改變物質結構和使體系發生其他反應，取45℃為最佳浸提溫度。

2.3 浸提時間對發芽糙米黃酮提取的影響

以液料比20:1加入體積分數50%的乙醇溶液，在45℃條件下分別提取20、30、40、50、60min，結果如圖3所示。

由圖3可知，隨著浸提時間的延長，發芽糙米黃酮提取量在30min內顯著增加，此后浸提時間對黃酮的提取量影響很小。從操作費用和能源消耗考慮，因此初步確定30min為最佳浸提時間。

圖3 浸提時間對發芽糙米黃酮提取量的影響Fig.3 Effect of extraction time on extraction rate of flavonoids

2.4 液料比對發芽糙米黃酮提取的影響

液料比對黃酮的溶出有直接的影響，也會對黃酮的提取造成影響。因此取不同的液料比，以體積分數50%的乙醇溶液為提取劑，超聲處理12min后在45℃條件下提取30min，結果如圖4所示。

圖4 液料比對發芽糙米黃酮提取量的影響Fig.4 Effect of material/liquid ratio on extraction rate of flavonoids

從圖4可知，隨著液料比的增加，黃酮的提取量在不斷的增高，這是因為增加液料比，傳質動力增加，黃酮就更容易溶出，損失減少；但液料比大于20:1后增加速度趨于平緩。因此考慮經濟效益，選取液料比為20:1(mL/g)。

2.5 響應面優化設計

2.5.1 試驗因素水平編碼與試驗結果

綜合單因素試驗結果，根據Box-Behnken試驗設計原則，以黃酮提取量為響應值，分析超聲處理時間、浸提溫度、浸提時間、料液比四因素三水平的響應面分析方法，各因素及水平編碼如表1所示。試驗設計及結果見表2。

表1 超聲波輔助提取發芽糙米黃酮工藝響應面試驗因素水平表Table 1 Factors and levels tested in response surface analysis

表2 超聲波輔助提取發芽糙米黃酮工藝響應面試驗設計及結果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

2.5.2 數據分析及模型建立

表3 二次響應面回歸模型方差分析及顯著性檢驗結果Table 3 ANOVA for the developed regression model

應用Design-Expert軟件，對表2中的數據進行回歸擬合分析，選擇對響應值影響顯著的各項，可得二次回歸方程為：

對回歸方程進行方差分析及顯著性檢驗的結果見表3。由表3可知，該回歸模型顯著(P＜0.0001)方程的一次性和二次項的影響都顯著，且交互項AB、AD、BC也顯著，且該模型的R2＝0.9679，R2Adj＝0.9359，說明該模型與試驗值擬合較好，可用于發芽糙米黃酮提取量評定的理論依據。

2.5.3 響應面因素水平的優化

回歸方程中影響顯著的交互項所做的響應曲面區及其等高線圖見圖5。

圖5 各兩因素交互作用對發芽糙米黃酮提取量影響的響應面及等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots showing the effects of pairwise interactions among various process conditions on extraction rate of flavonoids

通過該組圖即可對任何兩個因素交互影響發芽糙米黃酮提取量的效應進行分析和評價。通過矩陣分析得響應值Y有最大值時各因素的水平為A＝－0.1、B＝0.08、C＝0.05、D＝－0.22，轉換后可得發芽糙米黃酮的最佳提取條件為超聲時間11.7min、浸提溫度45.8℃、浸提時間30.5min、液料比18.9:1(mL/g)，此時黃酮提取量為0.754mg/g。

2.6 驗證實驗

對最佳提取工藝進行驗證實驗，得發芽糙米黃酮提取量實測值為(0.743±0.011)mg/g(n＝5)，比理論值0.754mg/g稍低，說明由于試驗條件的限制，回歸模型中還存在一些干擾因素。

3 結 論

采用Box-Behnken響應面法建立影響因素的二次回歸模型，對數據進行分析，得到發芽糙米黃酮的最佳提取工藝為超聲時間11.7min、浸提溫度45.8℃、浸提時間30.5min、料液比18.9:1(mL/g)，試驗誤差小，可用來實際預測和評價發芽糙米黃酮提取量的理論依據。

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Optimization of Ultrasound-Assisted Extraction of Flavonoids from Germinated Brown Rice Using Response Surface Methodology

LIU Zhen-chun，ZHANG Li-kuan，YU Chang，FENG Jian-guo
(College of Food Science and Technology, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

Total flavonoids were extracted from geminated brown rice by ultrasound-assisted extraction method using 50%ethanol as extraction solvent. Response surface methodology was employed to optimize the extraction conditions based on extraction rate. A quadratic regression model describing the effects of four process conditions on the extraction rate of total flavonoids was developed using a Box-Behnken experimental design. The response surface analysis showed that the optimal extraction conditions were extraction for 30.5 min at 45.8 ℃ and a material/liquid ratio of 18.9:1 (mL/g) after 11.7 min of ultrasound treatment. Under these conditions, the average extraction rate of total flavonoids was (0.743 ± 0.011) mg/g (n = 5),accounting for 98.5% of the predicted value, 0.754 mg/g. The developed regression model showed excellent goodness of fit.

germinated brown rice；flavonoids；ultrasound；response surface methodology (RSM)

TS201.2

A

1002-6630(2012)08-0080-05

2011-03-25

吉林省科技廳重點項目(2010026)

劉振春(1963—)，男，教授，博士，研究方向為食品營養與功能性食品。E-mail：liuzhenchun63@163.com