利用D-900樹脂對巴戟天多糖脫色工藝進(jìn)行優(yōu)化

陳振興，陳地靈，林 勵*，馮學(xué)軒，梁 杏，吳俊生

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

利用D-900樹脂對巴戟天多糖脫色工藝進(jìn)行優(yōu)化

陳振興，陳地靈，林 勵*，馮學(xué)軒，梁 杏，吳俊生

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

研究D-900陰離子交換樹脂對巴戟天多糖的最佳脫色工藝。采用D-900陰離子交換樹脂對巴戟天多糖進(jìn)行靜態(tài)和動態(tài)吸附試驗(yàn)，考察不同溫度、樹脂用量、流速和pH值等因素對吸附過程的影響，以脫色率和多糖保留率綜合評價其脫色效果。最佳工藝參數(shù)為：采用動態(tài)吸附，柱溶液溫度45℃、流速1.0BV/h、上樣液pH6.0。使用D-900陰離子交換樹脂對巴戟天多糖脫色可以獲得較好的脫色率以及較高的多糖保留率。

巴戟天；多糖；脫色；陰離子交換樹脂

巴戟天為茜草科植物巴戟天(Morinda officinalis How.)的干燥肉質(zhì)根，味甘、辛，性微溫，有補(bǔ)腎陽、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕之功效。主要分布在福建、廣東、廣西、海南等省的熱帶和亞熱帶地區(qū)，是我國著名的“四大南藥”之一。巴戟天中主要含有糖類、蒽醌、氨基酸、脂類、有機(jī)酸等化合物及無機(jī)元素[1]。其中，糖類物質(zhì)含量最高，成分復(fù)雜，藥理作用明顯[2-12]。現(xiàn)有研究資料表明巴戟天的許多臨床療效與此類成分有關(guān)[13-16]，具有十分廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。目前，由于提取工藝落后，得到的產(chǎn)物色澤呈棕褐色或黑色。色素的存在不僅影響多糖色澤，也阻礙了對多糖組成、結(jié)構(gòu)及其生物活性關(guān)系的研究。因此，對巴戟天多糖進(jìn)行脫色有很大的意義。常規(guī)脫色的方法一般有活性炭法，雙氧水法等，但這些方法用于巴戟天多糖的脫色均存在缺陷，采用活性炭吸附脫色，耗時長、多糖損失率大、難以濾過；采用雙氧水脫色，效果不理想，且H2O2具有氧化性，可能破壞多糖的生物活性。

D-900陰離子交換樹脂主要用于糖類等食品工業(yè)中的提取、脫色。其最大優(yōu)點(diǎn)是可在醇溶液的情況下直接上柱脫色，這樣既省略了一些不必要的工序，又可以減少有效成分的損失。且該樹脂具有再生效率高、交換容量大、體積變化小、洗脫效果好，抗污染能力強(qiáng)和機(jī)械強(qiáng)度好的優(yōu)點(diǎn)。迄今，利用大孔吸附樹脂對巴戟天多糖色素進(jìn)行吸附研究在國內(nèi)外尚無報道。

本實(shí)驗(yàn)采用D-900陰離子交換樹脂對巴戟天多糖的靜態(tài)吸附、動態(tài)吸附性能以及樹脂再生效果等因素進(jìn)行考察，以確定吸附及解吸附的最佳工藝參數(shù)，為巴戟天多糖的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

巴戟天鮮品于2010年9月26日采自德慶高良鎮(zhèn)巴戟天GAP種植基地，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院林勵研究員鑒定為茜草科植物巴戟天(Morinda officinalis How.)的干燥肉質(zhì)根，除去須根等雜質(zhì)，曬焉，抽去木心，再曬干；D-900樹脂 河北滄州寶恩吸附材料科技有限公司；D-葡萄糖 美國Amresco公司；苯酚、濃硫酸、濃鹽酸、氫氧化鈉、乙醇等試劑均為分析純；重蒸餾水 廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院GMP實(shí)驗(yàn)室。

DSH-300型多用途水浴恒溫振蕩器；HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋；Cary 50型紫外可見光分光光度計(帶石英比色皿) 美國Varian公司；BP211D電子分析天平 德國Sartorius公司；KQ-500超聲儀 昆明市超聲儀器有限公司；層析柱(1.5cm×20cm)；pH測定儀。

1.2 方法

1.2.1 巴戟天多糖測定方法

采用苯酚-硫酸法[17]測定多糖，以葡萄糖為對照品，測定巴戟天總糖含量。

1.2.2 苯酚-硫酸溶液的配制

精密稱取苯酚5.0g，置100mL容量瓶中，加新鮮蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，濾過至棕色瓶，得到5%苯酚溶液，置冰箱中備用。

1.2.3 最大吸收波長的確定

圖1 光譜掃描圖Fig.1 UV-visible scanning spectra of glucose and polysaccharide extract from Morinda officinalis How.

分別精確取1mL葡萄糖對照品溶液和0.5mL巴戟天待測樣品溶液于干燥的10mL具塞試管中，加水至總體積為1mL，加入1.0mL 5%苯酚溶液，搖勻，再加入5mL濃硫酸，搖勻，放置10min后，再在40℃水浴加熱18min，取出，流水冷卻至室溫后，以未加待測溶液為空白，在200～800nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描。結(jié)果表明(圖1)對照品和樣品在490nm處有相同吸收峰，故確定以490nm為測定波長。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密稱取干燥至質(zhì)量恒定的葡萄糖對照品0.1235g，加水溶解并定容至100mL量瓶中，再移取10mL葡萄糖溶液于100mL量瓶中，加水定容，搖勻，即得質(zhì)量濃度0.1235mg/mL的葡萄糖對照品溶液。

分別精密吸取葡萄糖對照品溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，按照1.2.3節(jié)方法顯色，在波長490nm處分別測定吸光度，以葡萄糖量為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制回歸曲線，結(jié)果表明：葡萄糖在0～0.123mg/mL范圍內(nèi)質(zhì)量濃度與吸光度呈線性相關(guān)。標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：Y＝8.7878X＋0.00222，R2＝0.9992。

1.2.5 巴戟多糖的提取、精制及換算因子測定

取巴戟天藥材100g，粉碎過20目篩，加入500mL無水乙醇，沸水浴回流脫脂及除去醇溶性成分(經(jīng)蒸發(fā)光檢測其醇溶液中含葡萄糖、果糖和蔗糖)，回流兩次。濾渣加水400mL熱回流2次，合并濾液，適當(dāng)濃縮，冷卻至室溫，加乙醇至90%，冷藏48h，濾取沉淀，揮干，至乙醇味消失后溶于水中，用Sevag法除蛋白3次，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至稠膏狀，轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿中60℃真空干燥箱中干燥，得巴戟多糖。

1.2.6 多糖含量測定

吸取巴戟天多糖待測液1mL，在1.2.3節(jié)確定的最大吸收波長下測定吸光度(A)，由1.2.4節(jié)得到的回歸方程計算待測液中葡萄糖質(zhì)量濃度(C)，按照下式計算樣品中巴戟天多糖含量：

式中：C為巴戟天多糖待測液中葡萄糖的質(zhì)量濃度/(mg/mL)；f為換算因子；m為稱取多糖的質(zhì)量/mg；b表示多糖稀釋倍數(shù)。

1.2.7 多糖保留率計算

式中：M前、M后分別為脫色前后的多糖含量。

1.2.8 脫色率的測定及計算方法

質(zhì)量濃度0.5mg/mL巴戟天多糖溶液，在200～800nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描。結(jié)果表明在波長410nm處有最大吸收，故確定以波長410nm處的吸光度變化考察樹脂的脫色效果。

式中：A脫色前、A脫色后分別為脫色前后溶液的吸光度。

1.2.9 樹脂的預(yù)處理

新樹脂必須經(jīng)過預(yù)處理，將其中的有機(jī)物、低聚物以及有害離子等雜質(zhì)除去。首先使用飽和食鹽水，取其量約等于被處理樹脂體積的兩倍，將樹脂置于食鹽溶液中浸泡18～20h，然后放盡食鹽水，用清水漂洗凈，使排出水不帶黃色；而后用5% HCl溶液浸泡4～8h，然后放盡酸液，用水清洗至中性；而后用2%～4% NaOH溶液浸泡4～8h后，放盡堿液，用清水洗至中性待用。

2 結(jié)果與分析

2.1 D-900樹脂對巴戟天多糖色素的靜態(tài)吸附試驗(yàn)

精確稱量預(yù)處理好的樹脂1、2、3、4、5g，轉(zhuǎn)入裝有10mL質(zhì)量濃度1.5mg/mL巴戟天多糖溶液錐形瓶中，分別在室溫(20)、25、35、45、55℃條件，以140r/ min振蕩2h后，過濾，取濾液轉(zhuǎn)入100mL容量瓶，加水定容，測定溶液脫色后的吸光度，并按照1.2.3節(jié)方法顯色，測定溶液中多糖的吸光度[18-19]。分別計算多糖保留率和脫色率，結(jié)果見圖2。

圖2 各溫度下樹脂對多糖的脫色率(A)和保留率(B)Fig.2 Effect of static adsorption temperature on decolorization rate and polysaccharide retention rate

圖2表明，不同溫度下，不同樹脂用量對色素的吸附能力表現(xiàn)各異，同時也對多糖有不同的交換吸附作用。由圖2A可知，溫度越高，樹脂對巴戟天多糖色素的吸附作用越強(qiáng)，吸附效果越好，且45℃和55℃的脫色率相差不大。由圖2B可知，45℃下多糖保留率達(dá)到最高，溫度降低或升高均使多糖保留率降低。綜合考慮選擇45℃作為最佳的脫色吸附溫度，達(dá)到吸附平衡的最佳樹脂用量是3g(1.5mg/mL巴戟天多糖提取液10mL)。

2.2 D-900樹脂對巴戟天多糖色素的動態(tài)吸附研究

將預(yù)處理好的樹脂以濕法攪拌下裝入層析柱中，樹脂層析柱高為10cm，巴戟天多糖提取液20mL以一定流速通過交換柱，進(jìn)行動態(tài)脫色試驗(yàn)。收集洗脫液定容至200mL容量瓶，加水稀釋至刻度線。取定容后的洗脫液1.0mL，按照1.2.3節(jié)顯色方法和最佳波長測定溶液吸光度，分別計算多糖保留率和脫色率。試驗(yàn)分別考察樹脂柱高、上柱液流速、溫度和pH值等因素[20-21]對洗脫效果的影響，并得出適宜的脫色條件[22]。

2.2.1 柱高對巴戟天多糖色素的吸附研究

將預(yù)處理好的樹脂以濕法攪拌下裝入層析柱中，柱高分別為4.5、8.0、10.0、12.5、15.0cm，巴戟天多糖提取液20mL以一定流速通過交換柱，分別計算多糖保留率和脫色率。結(jié)果見圖3。

圖3 不同樹脂柱高對多糖提取液脫色效果的影響Fig.3 Effect of resin column height on decolorization rate and polysaccharide retention rate

由圖4可知：樹脂柱高對巴戟天多糖提取液的多糖吸附和脫色效果有顯著效果，隨著柱高的變化，多糖保留率逐漸降低，脫色率逐漸升高。本實(shí)驗(yàn)選取10cm樹脂柱高作為脫色柱高(巴戟天多糖溶液20mL)，考察在其他因素下，D-900樹脂對巴戟天多糖色素的吸附影響。

2.2.2 上柱液流速對D-900樹脂吸附研究

由圖4可知，隨著上柱液的流速加快，樹脂對多糖的吸附增加，多糖保留率減少，同時，也對色素的吸附能力降低，造成脫色率降低。樹脂吸附過程中，多糖提取溶液的流速慢有利于上柱液中色素在樹脂床中充分?jǐn)U散，使其容易充分被樹脂吸附。當(dāng)流速0.2BV/h時，多糖保留率和脫色效果最佳，但流速太慢又會影響生產(chǎn)效率，使生產(chǎn)周期拖長。若增加流速，多糖的吸附量也會增加，流速過高會使多糖沒有足夠的時間擴(kuò)散到樹脂內(nèi)部，影響脫色效果，綜合考慮，選取1BV/h的流速作為最佳流速。

圖4 流速對多糖提取液脫色效果的影響Fig.4 Effect of sample loading flow rate on decolorization rate and polysaccharide retention rate

2.2.3 柱溶液的溫度對D-900樹脂吸附研究

圖5 溫度對多糖提取液脫色效果的影響Fig.5 Effect of dynamic adsorption temperature on decolorization rate and polysaccharide retention rate

由圖5可知，隨上柱液溫度的升高，脫色率和多糖保留率也升高，并且在45℃達(dá)到最大值，55℃時吸附效果減弱，脫色率和多糖保留率稍有減少。結(jié)果得出45℃是較適宜的吸附溫度，溫度過低或過高，樹脂對多糖的吸附增加，多糖保留率減少，同時，對色素的吸附能力也會較低，造成脫色率下降。故選取45℃作為最佳的柱溶液溫度。

2.2.4 上柱液pH值對D-900樹脂的吸附研究

圖6 pH值對多糖脫色效果的影響Fig.6 Effect of sample pH on decolorization rate and polysaccharide retention rate

由圖6可知，pH值對巴戟天多糖的脫色效果和多糖保留率均存在影響。隨pH值的升高，脫色率和多糖保留率都在升高。巴戟天多糖提取液的pH值較大時，色素在弱酸性的條件下易于被吸附，吸附效果好。酸性增強(qiáng)，樹脂對多糖的吸附能力增強(qiáng)，使多糖的保留率下降。當(dāng)pH6時，巴戟天多糖的保留率最高，脫色效果最好，故選取pH6為上柱液的最佳pH值。

2.3 最佳工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

按照動態(tài)試驗(yàn)得出的最佳工藝條件為上柱液溫度45℃、流速1BV/h、pH6.0，按照最佳工藝條件吸取巴戟天多糖提取液20mL，過樹脂高為10cm的樹脂柱，收集洗脫液。洗脫液轉(zhuǎn)至200mL容量瓶，加水定容。取定容后的洗脫液測定波長410nm處的吸光度，另取1.0mL，按照1.2.3節(jié)顯色方法測定溶液吸光度，分別計算脫色率和多糖保留率。做3次平行試驗(yàn)，結(jié)果脫色率(70.81± 1.29)%，多糖保留率(83.35±0.39)%。

2.4 樹脂的解吸及再生

樹脂吸附色素后可再生重復(fù)利用，本試驗(yàn)用95%乙醇溶液作為洗脫劑，以一定流速通過吸附柱進(jìn)行洗脫解吸試驗(yàn)，收集流出液，照1.2.3節(jié)分析方法測定溶液吸光度，當(dāng)吸光度接近“0”時、依次用純水、3%～5%HCl溶液、純水(洗至pH6～7)、3%～5% NaOH溶液、純水(洗至pH7～8)，然后反洗，正洗，即可再用。

3 結(jié) 論

通過對巴戟天多糖提取液在D-900樹脂上的靜態(tài)吸附行為研究，發(fā)現(xiàn)樹脂對多糖提取液的多糖成分和色素均有吸附作用，綜合考慮多糖保留率和脫色率，得出D-900大孔樹脂在45℃、樹脂用量3.0g(1.5mg/mL多糖提取液10mL)時為最佳條件，該條件下，多糖保留率69.0%、脫色率65.7%。

通過對巴戟天多糖提取液在D-900樹脂上的動態(tài)吸附行為研究，得出脫色的最佳工藝參數(shù)為流速1.0BV/h、柱溶液溫度45℃、上層析柱溶液pH6，在此條件下，對巴戟天多糖提取液的多糖保留率約為83.4%，脫色率為70.9%。

綜合離子交換樹脂的靜態(tài)吸附試驗(yàn)和動態(tài)吸附試驗(yàn)分析，動態(tài)吸附試驗(yàn)下，離子交換樹脂對巴戟天多糖色素的吸附較多，而且多糖保留率較高。物理化學(xué)的觀點(diǎn)認(rèn)為，離子交換樹脂的脫色過程既有交換過程，也有吸附過程。離子交換樹脂具有一定的活性表面，當(dāng)其表面與一種溶液接觸時，由于表面能的作用，使溶質(zhì)聚集到樹脂表面上，即產(chǎn)生吸附作用， 吸附過程也就是表面自由焓降低的過程。離子交換樹脂對多糖溶液色素的脫除是離子交換過程與吸附過程。大孔吸附樹脂是一類有機(jī)高聚物吸附劑，具有大孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和較大的比表面積，可通過物理吸附從水溶液中選擇性的吸附有機(jī)物，作用條件比較溫和[22]。靜態(tài)吸附試驗(yàn)下，樹脂對多糖溶液色素的脫除主要為吸附過程，同時也會吸附一定的多糖成分，而動態(tài)吸附比靜態(tài)吸附試驗(yàn)的多糖保留率和脫色率都高，原因是動態(tài)條件下，上柱液在樹脂上流動，不斷交換，多糖成分為大分子，能更好地洗脫出來，而色素屬于小分子，經(jīng)歷樹脂的離子交換和吸附過程，被樹脂很好地吸附。動態(tài)吸附，條件易于控制，操作簡便，故可作為工業(yè)生產(chǎn)的最佳選擇。

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Optimization of Decolorization of Polysaccharides from Morinda officinalis How. Using D-900 Resin

CHEN Zhen-xing，CHEN Di-ling，LIN Li*，F(xiàn)ENG Xue-xuan，LIANG Xing，WU Jun-sheng

(School of Chinese Materia Medica, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, China)

This study was undertaken to optimize the decolorization of polysaccharides from Morinda officinalis How. using D-900 anion exchange resin. Static and dynamic adsorption experiments were carried out to study the effects of temperature, resin dose, sample loading flow rate and pH on decolorization rate and polysaccharide retention rate. The optimal process parameters were dynamic adsorption at a sample loading flow rate of 1.0 BV/h, sample pH 6.0 and 45 ℃. In conclusion, higher decolorization rate and polysaccharide retention rate could be obtained by using D-900 anion exchange resin

Morinda officinalis How.；polysaccharide；discoloration；anion exchange resin

R284.2

A

1002-6630(2012)08-0071-05

2011-03-29

海南省重點(diǎn)科技項(xiàng)目(090603)；廣東省科技計劃項(xiàng)目(2011B031700062)；2011年省級大學(xué)生實(shí)驗(yàn)創(chuàng)新項(xiàng)目(1057211018)

陳振興(1987—)，男，碩士研究生，主要從事中藥資源開發(fā)利用與新藥研究。E-mail：416158716@qq.com

*通信作者：林勵(1954—)，男，研究員，本科，主要從事中藥資源開發(fā)利用與新藥研究。E-mail：LL76611@yahoo.com.cn