纖維素酶-微波輔助提取軟棗獼猴桃莖黃酮的工藝優(yōu)化

張春紅，許 寧，吳 雙，劉長江*

(沈陽農(nóng)業(yè)大學食品學院，遼寧 沈陽 110866)

纖維素酶-微波輔助提取軟棗獼猴桃莖黃酮的工藝優(yōu)化

張春紅，許 寧，吳 雙，劉長江*

(沈陽農(nóng)業(yè)大學食品學院，遼寧 沈陽 110866)

采用纖維素酶-微波輔助法提取軟棗獼猴桃莖中的黃酮類物質(zhì)。通過單因素試驗確定纖維素酶的添加量、酶解時間、作用溫度、pH值的適宜水平，在此基礎上，采用響應曲面法，通過方差分析建立數(shù)學模型，得到軟棗獼猴桃莖黃酮提取的最佳工藝條件：纖維素酶添加量438U/g、酶解時間64min、作用溫度49℃、pH4.7，在此條件下軟棗獼猴桃莖黃酮提取率為2.89%。

軟棗獼猴桃莖；黃酮類物質(zhì)；纖維素酶；微波；響應面分析

軟棗獼猴桃(Actinidia arguta Sieb．et Zucc．)，又名軟棗子、獼猴梨、藤瓜，屬于獼猴桃科(Actinidiaceae)、獼猴桃屬(Actinidia)多年生落葉藤本植物[1]。國外研究表明，軟棗獼猴桃莖中含有豐富的黃酮類化合物，特別是其中的(＋)-兒茶素和(-)-表兒茶素具有促進骨髓細胞增殖的功能活性[2]。在冬季，軟棗獼猴桃的枝條被修剪下來，很多枝條被拋棄在田間地頭，造成了資源的浪費。現(xiàn)代藥理研究表明，黃酮類化合物具有多種生物活性[3-6]，如清除自由基、抗脂質(zhì)過氧化、抗病毒、防衰老、抗癌、保肝護肝及防治糖尿病等作用。因此，從軟棗獼猴桃莖中提取黃酮類化合物作為功能性食品或藥品的原料具有較好的開發(fā)前景。

在國內(nèi)對軟棗獼猴桃莖中黃酮類化合物的提取尚沒有較成熟的方法，而如有機溶劑浸提和熱水提取等傳統(tǒng)法不能將被包裹在植物細胞壁組織中的有效成分完全的提取出來。細胞壁的主要成分是纖維素，纖維素酶能使細胞壁疏松、破裂，減少傳質(zhì)阻力，從而提高提取效率[7]。在國內(nèi)外對植物原料活性成分的提取方法中，微波輔助法已被廣泛采用，可以降低能源消耗，節(jié)省提取時間，并且生產(chǎn)設備簡單無污染[8-9]。為了充分利用軟棗獼猴桃資源，本研究采用酶法與微波輔助法相結合，從軟棗獼猴桃莖中提取黃酮類化合物，并確定最佳提取工藝條件，為今后軟棗獼猴桃莖黃酮類化合物的開發(fā)利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

軟棗獼猴桃莖產(chǎn)自遼寧省本溪市；蘆丁標準品(分析純) 上海源葉生物科技有限公司；纖維素酶(酶比活力≥15000.0U/g) 國藥集團化學試劑有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

U291型紫外可見分光光度計 日本Hitachi公司；HD-5型電腦紫外檢測儀 上海滬西分析儀器廠；RE-52型旋轉蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；5805型高速冷凍離心機 德國Investment公司；PB-10型數(shù)顯pH計 德國Sartorius公司；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；YP1002N電子天平 上海舜宇恒平科學儀；DHG-90240A電熱恒溫鼓風干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司；MAS-I型微波爐 上海新儀微波化學科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 總黃酮含量的測定

采用 Al(NO3)3-NaNO2法[10-11]。

1.3.2 脂肪、色素等雜質(zhì)的脫除。

采用索氏提取法。

1.3.3 軟棗獼猴桃莖樣粉的制備

將軟棗獼猴桃鮮莖洗凈，剪成段，在40℃條件下烘干，粉碎，經(jīng)石油醚脫脂脫色后烘干至無殘留，得到軟棗獼猴桃莖樣粉，至低溫避光處保存，一周內(nèi)備用。

1.3.4 纖維素酶-微波提取工藝

稱取1.00g樣粉于錐形瓶中，加入10mL一定pH值的磷酸緩沖溶液和定量的纖維素酶，于指定溫度下水浴酶解至相應時間后于沸水浴滅酶5min， 加入無水乙醇使其體積分數(shù)為70%，在料液比為1:32(g/mL)、微波功率300W的條件下，提取時間5min(每間隔1min微波1次，每次作用1min)。微波處理后所得浸提液稍冷卻，然后在4℃條件下6000r/min離心10min，過濾，去除濾渣，所得濾液減壓濃縮，再用體積分數(shù)6 0%乙醇定容至100mL容量瓶，所得樣液待測[12-14]。

1.3.5 軟棗獼猴桃莖黃酮提取率計算方法

取不同試驗條件下所得的定容樣液按Al(NO3)3-NaNO2法測定，用紫外-可見分光光度計在510nm處比色，得吸光度，以A510表示，根據(jù)標準曲線求得樣液黃酮質(zhì)量濃度，按下式計算黃酮提取率：

1.3.6 統(tǒng)計分析

每組單因素試驗重復3次。在單因素試驗基礎上，采用Minitab軟件進行試驗設計及和顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的制定

采用Al(NO3)3-NaNO2法，精確稱取蘆丁標準品5mg，放于25mL容量瓶中，溶于體積分數(shù)60%乙醇溶液中，定溶至刻度，配成0.2mg/mL蘆丁標準溶液。分別取0、1、2、3、4、5、6mL標準溶液于25mL容量瓶中，以蒸餾水補足至6mL，加質(zhì)量分數(shù)5%亞硝酸鈉溶液1mL，放置6min；加質(zhì)量分數(shù)10%硝酸鋁溶液1mL，放置6min；再加質(zhì)量分數(shù)10%氫氧化鈉溶液10mL，體積分數(shù)60%乙醇定容，搖勻，放置15min，于510nm下測定吸光度，以蘆丁質(zhì)量濃度x/(μg/mL)為橫軸，以吸光度(A)為縱軸繪制標準曲線，見圖1，得回歸方程為A＝0.0083x＋0.0052，R2＝0.9992。

圖1 蘆丁標準曲線Fig.1 Standard curve of rutin

2.2 單因素試驗

2.2.1 纖維素酶添加量對黃酮提取率的影響

準確稱取6份1.00g軟棗獼猴桃莖樣粉，加入10mL pH4.0的磷酸緩沖液，分別按每克樣粉100～600U的纖維素酶作為作用酶，于45℃作用1h，沸水浴滅酶后微波輔助提取，測定其中黃酮質(zhì)量濃度，計算提取率，結果見圖2。

圖2 加酶量對黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of cellulose concentration on extraction rate of flavonoids

由圖2可知，隨著纖維素酶的添加量的增加，軟棗獼猴桃莖黃酮的提取率增大，當加酶量達到400U/g后，黃酮的提取率隨著加酶量的增加沒有明顯提高，綜合經(jīng)濟因素考慮，選擇酶的添加量為400U/g時為適宜的酶的添加量。

2.2.2 pH值和作用溫度對黃酮提取率的影響

其余條件同2.2.1節(jié)，每份軟棗獼猴桃莖樣粉添加400U/g的纖維酶，研究不同pH值對黃酮提取率的影響，結果見圖3。

圖3 pH值對黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of pH on extraction rate of flavonoids

由圖3可知，pH值和作用溫度對軟棗獼猴桃莖中黃酮提取率有明顯影響。當pH值由3.5升到4.5時，黃酮的提取率迅速增大，而當pH值斷續(xù)增大時，黃酮提取率反而開始下降，分析原因是每種酶類物質(zhì)都有其最適的作用pH值，當pH值為4.5時，處于纖維素酶的最佳作用pH值區(qū)間(4.0～6.0)里，能夠發(fā)揮纖維素酶的最大活力，使之最大限度作用于細胞壁纖維素；因此，纖維素酶在pH 4.5時酶解的效果較好。

2.2.3 作用溫度對黃酮提取率的影響

其余條件同2.2.2節(jié)，在pH4.5的條件下，研究不同溫度對黃酮提取率的影響，結果見圖4。

圖4 作用溫度對黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of hydrolysis temperature on extraction rate of flavonoids

由圖4可知，隨著作用溫度的提高，軟棗獼猴桃莖黃酮提取率逐漸增大，但當溫度高于50℃后，其提取率開始下降，這是因為當溫度上升到50℃時，纖維素酶達到了最適的作用溫度，而溫度再高則使蛋白質(zhì)變性，從而影響了酶的活性[10]。

2.2.4 酶解時間對黃酮提取率的影響

其余條件同2.2.3節(jié)，研究50℃條件下，不同酶解時間對黃酮提取率的影響，結果見圖5。

圖5 酶解時間對黃酮提取率的影響Fig.5 Effect of hydrolysis time on extraction rate of flavonoids

由圖5可知，隨著酶解時間的延長，軟棗獼猴桃莖黃酮的提取率在不斷的提高，但是60min后，黃酮的提取率趨于穩(wěn)定，沒有顯著的變化，因此從節(jié)省時間，降低成本的角度考慮，60～80min為適宜的提取時間。

2.3 響應面優(yōu)化試驗

2.3.1 試驗設計及結果

以單因素試驗結果為基礎，采用Box-Behnken設計法進行試驗設計[8]，并以上述四個因素為自變量，軟棗獼猴桃莖黃酮提取率(Y)為響應值，設計了四因素三水平共27個試驗點的響應面分析試驗，其因素水平編碼值見表1，結果見表2。

表1 響應面試驗因素和水平編碼值Table 1 Coded values and corresponding real values of the optimization parameters tested in response surface analysis

將表2所得的試驗數(shù)據(jù)采用Minitab統(tǒng)計軟件進行回歸分析，四個因素經(jīng)過擬合得到以黃酮提取率(Y)為目標函數(shù)的二次回歸方程：

表2 Box-Behnken試驗設計及結果Table 2 Box-Behnken experimental design and results for response surface analysis

表3 回歸系數(shù)及顯著性檢驗Table 3 Regression coefficients and their significance in the fitted regression model

由表3可看出，作用溫度對提取率影響顯著(P＜0.05)，纖維素酶的添加量、酶解時間和pH值對黃酮類化合物的提取率影響極顯著(P＜0.001)。響應回歸模型(P＜0.001)，達到了極顯著水平，說明該方程能夠正確反映軟棗獼猴桃莖黃酮提取率與各因素之間的關系。失擬項P＝0.516＞0.05，不顯著，說明本試驗無其他因素的顯著影響，方程對試驗擬合良好，試驗誤差小。相關系數(shù)R2＝0.9814，表明有98.14%的數(shù)據(jù)可以用此回歸模型來解釋。

2.3.2 響應面分析

利用Minitab軟件即可以作出兩因素交互作用的響應曲面圖及其等高線圖，見圖6。

圖6 各因素交互作用對黃酮提取率的影響Fig.6 Response surface and contour plots for the effects of cellulose dose, extraction temperature and bydrolysis time on extraction rate of flavonoids

從圖6A可以看出，等高線沿纖維素酶的添加量軸向變化較作用溫度軸向變化相對密集，曲面較陡，說明纖維素酶的添加量對黃酮提取率的影響較顯著，并且在纖維素酶的添加量為300～400U/g時，黃酮的提取率受影響較敏感。從圖6B可以看出，等高線沿酶解時間軸向變化相對密集，而沿作用溫度軸向變化相對稀疏，說明在酶解時間與作用溫度交互作用的情況下，酶解時間較作用溫度對響應值的影響較大，隨著酶解時間和作用溫度的增大，黃酮的提取率先快速提高后又緩慢降低。從圖6C可以看出，在pH值較大范圍內(nèi)均可以得到較大的響應值，等高線沿pH值軸向變化密集程度略大于作用溫度軸向方向，說明在pH值對響應值的影響比作用溫度影響顯著。從圖6可以看出，三組交互作用的等高線圖都呈橢圓形，說明以上三組交互作用都很強，影響顯著，圖6A曲面最陡，說明纖維素酶的添加量與溫度的交互作用對黃酮提取率的影響最顯著。

2.2.3 最佳工藝條件的確定

通過軟件Minitab分析，得出最優(yōu)的提取工藝條件為纖維素酶的添加量438.38U/g、酶解時間63.83min、作用溫度49.44℃、pH4.74，此時軟棗獼猴桃莖黃酮的提取率達到極值為2.91%。為檢驗結果的可靠性，考慮實驗室試驗條件，采用纖維素酶的添加量438U/g、酶解時間64min、作用溫度49℃、pH4.7的修正條件進行平行試驗，結果得出軟棗獼猴桃莖黃酮的實際提取率為2.89%，與理論預測值基本吻合，因此，響應面模型具有可行性。

3 結 論

在單因素試驗的基礎上，采用響應面法對纖維素酶-微波輔助法提取軟棗獼猴桃莖黃酮類化合物的工藝條件進行了優(yōu)化，研究發(fā)現(xiàn)作用溫度對提取率影響顯著，纖維素酶的添加量、酶解時間和pH值對黃酮類化合物的提取率影響極顯著；在因素交互作用中，纖維素酶的添加量與溫度的交互作用最顯著。優(yōu)化后的最佳工藝條件為纖維素酶的添加量438U/g、酶解時間64min、作用溫度49℃、pH4.7，此條件下軟棗獼猴桃莖黃酮提取率為2.89%。

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Optimization of Cellulase Pretreatment for Microwave-Assisted Extraction of Flavonoids from Actinidia arguta Stem

ZHANG Chun-hong，XU Ning，WU Shuang，LIU Chang-jiang*
(College of Food, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China)

Cellulase pretreatment before microwave-assisted extraction of flavonoids from Actinidia arguta stem was optimized by response surface methodology. One-factor-at-a-time experiments were performed to select appropriate levels of enzyme dose, hydrolysis time, temperature and pH. Further, a mathematical model was built and subjected to variance analysis. The optimal cellulase hydrolysis conditions were determined as follows: the optimal enzyme dose was 438 U/g for 64 min of hydrolysis at 49 ℃ and pH 4.7. Under these conditions, the extraction rate of flavonoids was up to 2.89%.

Actinidia arguta stem；flavonids；cellulose；microwave；response surface methodology

R284.2

A

1002-6630(2012)08-0024-05

2011-04-11

農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)科研專項(200903013)

張春紅(1968—)，女，副教授，博士，主要從事植物蛋白質(zhì)、酶工程研究。E-mail：helloxuning@sina.com

*通信作者：劉長江(1955—)，男，教授，博士，主要從事食品生物技術研究。E-mail：liucj597@sohu.com