異甘露聚糖酶生產(chǎn)菌的誘變育種及固態(tài)發(fā)酵條件的優(yōu)化

穆昭艷，汪立平,*，張大兵，李安雪，汪 欣

(1.上海海洋大學食品學院，上海 201306；2.上海交通大學生命科學技術(shù)學院，上海 200240)

異甘露聚糖酶生產(chǎn)菌的誘變育種及固態(tài)發(fā)酵條件的優(yōu)化

穆昭艷1，汪立平1,*，張大兵2，李安雪1，汪 欣1

(1.上海海洋大學食品學院，上海 201306；2.上海交通大學生命科學技術(shù)學院，上海 200240)

為了提高異甘露聚糖酶活性，對實驗室保藏的一株分泌異甘露聚糖酶的枯草芽孢桿菌K-6(Bacillus subtilisK-6)進行紫外誘變育種，并優(yōu)化一株正突變株的固態(tài)發(fā)酵條件。出發(fā)菌株枯草芽孢桿菌K-6的酶活力為206.0U/mL，經(jīng)紫外線誘變處理后，挑選在培養(yǎng)基上透明水解圈較大的菌株進一步復篩，獲得枯草芽孢桿菌K-6-9高產(chǎn)突變株，酶活力為349.3U/mL，高于出發(fā)菌株69.6%。連續(xù)5代發(fā)酵，K-6-9的酶活力范圍為343.0～350.3U/mL，表明該突變菌株產(chǎn)酶性能穩(wěn)定。以K-6-9為菌種，采用單因素試驗和正交試驗進行最佳固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶條件的優(yōu)化，結(jié)果表明：該突變株的固態(tài)發(fā)酵適宜發(fā)酵條件為：發(fā)酵時間72h、接種量3%、初始pH 7.5、裝料量25g/250mL；培養(yǎng)基組成為：酵母細胞壁添加量8%、料液比1:1.2、麩皮添加量40%，此優(yōu)化條件下固態(tài)發(fā)酵K-6-9菌株產(chǎn)酶酶活力最高達601.6U/mL。

異甘露聚糖酶；誘變育種；固態(tài)發(fā)酵

甘露聚糖酶是一種內(nèi)切水解酶[1]，作用底物主要是甘露聚糖，其主要水解產(chǎn)物為單糖、二糖、三糖、四糖等低聚糖[2]。根據(jù)其作用底物不同，甘露聚糖酶可分為β-甘露聚糖酶和異甘露聚糖酶[3]，其中，β-甘露聚糖酶的作用底物為魔芋粉、槐豆膠等植物多糖，通過β-1,4-D-甘露吡喃糖苷鍵連接而成的直鏈或支鏈聚合糖；異甘露聚糖酶的作用底物為主要存在于酵母等微生物的細胞壁中的異甘露聚糖，異甘露聚糖以α-1,6-D-甘露糖為骨架鏈，其中大部分甚至全部的殘基具有α-1,2-或-1,3-連接的含有2～5個甘露糖殘基的側(cè)鏈。經(jīng)異甘露聚糖酶水解得到的甘露寡糖經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)對動物的生長發(fā)育具有一系列積極作用。如促進動物生長、提高動物的飼料轉(zhuǎn)化效率[4-6]；促進消化，改善動物腸道微生物生態(tài)環(huán)境及健康狀況[7]；促進動物腸道有益菌的生長[8]；提高機體免疫活性和抑制腫瘤生長[9]；吸附真菌毒素，減少抗生素等化學藥物的使用是生產(chǎn)綠色動物食品的添加劑[10]。

啤酒廢酵母是啤酒生產(chǎn)中最主要的副產(chǎn)物，我國大多數(shù)廠家主要處理啤酒廢酵母的方式是將其直接干燥后作為飼料，其經(jīng)濟效益甚微[11]。因此利用微生物技術(shù)將啤酒廢酵母中的甘露聚糖開發(fā)出附加值高、技術(shù)含量高、有足夠競爭性的甘露寡糖新產(chǎn)品，可為廢棄的啤酒酵母再利用提供了新思路，并提高了經(jīng)濟效益和社會效益。本研究將以實驗室保藏的分泌異甘露聚糖酶的一株枯草芽孢桿菌K-6為出發(fā)菌株，通過紫外誘變育種進行菌種改良，并對誘變改良后的最優(yōu)菌株的產(chǎn)酶固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化，從而高效制備異甘露聚糖酶，為啤酒廢酵母中甘露聚糖的充分利用提供理論基礎(chǔ)和部分技術(shù)參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

產(chǎn)異甘露聚糖酶的枯草芽孢桿菌K-6(Bacillus subtilisK-6)菌株，由上海海洋大學食品學院食品科學與生物技術(shù)研究室篩選和保藏。

瓊脂粉、酵母浸膏、蛋白胨、氯化鈉、磷酸氫二鈉、檸檬酸 國藥集團化學試劑有限公司；槐豆膠美國Sigma公司；酵母細胞壁 本實驗室自制[12]；麩皮市售。

1.2 儀器與設(shè)備

PHX-DHS-X型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進醫(yī)療器械廠；YXQLD31-400型立式消毒鍋 上海江南容器廠；電熱鼓風干燥箱 重慶銀河試驗儀器有限公司；潔凈工作臺SW-CJ-1F 上海博迅實業(yè)有限公司；UV-2000分光光度計 上海安亭科學儀器廠；CR21G冷凍離心機 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基配制

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：酵母細胞壁3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、水1000mL、瓊脂15g；活化培養(yǎng)基：酵母細胞壁3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、水1000mL、瓊脂15g；發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母細胞壁8g、蛋白胨10g、NaCl 5g、水1000mL；初始固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：水50%、麩皮40%、酵母細胞壁8%、NaCl 0.5%，初始接種量2%。

1.3.2 出發(fā)菌株篩選

用基礎(chǔ)培養(yǎng)基對產(chǎn)異甘露聚糖酶的菌株進行分離純化，將純化后的單個菌落點種到培養(yǎng)基上，37℃發(fā)酵24h后進行產(chǎn)酶篩選，選取產(chǎn)酶活性較高且穩(wěn)定的菌株作為誘變育種的出發(fā)菌株。

1.3.3 菌懸液制備

將確定的出發(fā)菌株進行液體發(fā)酵，至對數(shù)生長期后取菌液進行離心，用無菌生理鹽水調(diào)整到濃度為108CFU/mL的細胞懸液備用。

1.3.4 致死曲線的繪制

每組取6mL菌懸液，放入直徑為9cm的平皿中，在黑暗中用15W紫外燈距離30cm在磁力攪拌器下分別照射0(對照組)、30、45、60、90、120、180s，將誘變后的菌液采用稀釋涂布法[13]涂布于平板上，稀釋梯度為10-1～10-7，取各劑量的 10-1、10-3、10-5、10-74 個梯度的細胞懸液0.1mL涂布于基礎(chǔ)培養(yǎng)基平板，每個梯度涂2個，涂布后立即用黑牛皮紙包扎好，倒置37℃避光發(fā)酵24h。以未誘變菌液發(fā)酵后的菌落數(shù)為基準計算不同誘變時間的致死率，以照射時間為橫坐標，致死率為縱坐標繪制殺菌曲線。

式中：n1為對照組的菌落總數(shù)/(CFU/mL)；n2為誘變處理后的菌落總數(shù)/(CFU/mL)。

1.3.5 紫外線誘變及篩選

選取致死率在80%～90%的紫外線照射時間作為最適處理劑量處理出發(fā)菌株。挑取突變菌株點種到基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，利用碘液進行初篩，通過比較原始菌株的水解圈直徑與菌落直徑的比值(H/C)，篩選出產(chǎn)酶能力強的正突變菌株，選擇H/C相對較大的15株菌株利用DNS法進一步復篩。紫外誘變后所有操作在紅燈下進行，紫外線誘變每一次都是以此次誘變的前次誘變篩選出的酶活力增幅最大的菌株作為出發(fā)菌株，重復前面誘變及篩選的步驟。連續(xù)誘變11次。

1.3.6 遺傳穩(wěn)定性的測定

將篩選出的突變菌株連續(xù)轉(zhuǎn)接5代，分別測定各代菌株酶活力的大小，以測定其遺傳穩(wěn)定性。

1.3.7 粗酶液的制備

取培養(yǎng)好的固體產(chǎn)酶培養(yǎng)基10g加入蒸餾水100mL，攪拌均勻后40℃保溫1h后過濾，取濾液3000r/min離心10min，取上清液即為粗酶液[14]。

1.3.8 異甘露聚糖酶活力的測定

采用DNS法測定酶活力[2]，用0.1mol/L檸檬酸和0.2mol/L磷酸氫二鈉緩沖液配制成pH值為6.5的以酵母細胞壁為底物的溶液，酵母細胞壁的質(zhì)量濃度為0.5g/L。因為很難制備得到純的酵母甘露聚糖，且酵母甘露聚糖在酵母細胞壁中是以糖蛋白的混合物形式存在，所以直接使用酵母細胞壁代替酵母甘露聚糖作為底物。取底物緩沖液0.9mL預熱至60℃，添加0.1mL的粗酶液，60℃反應10min，加入1mL DNS試劑，然后在沸水浴中顯色5min，取出冷卻后用蒸餾水定容至10mL，搖勻，于540nm波長處測定OD值。異甘露聚糖酶活力的定義為：底物每分鐘釋放出相當于1μmolD-甘露糖的還原糖所需的酶量為1個酶活力單位(U)。

1.3.9 種子液的制備

將菌株接種到10mL活化培養(yǎng)基的試管中37℃發(fā)酵24h后，按照10%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵，37℃、200r/min振蕩發(fā)酵24h，得到的菌液即為種子液。

1.3.10 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

在原固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，選擇酵母細胞壁添加量和氮源及氮源添加量2個因素進行了單因素梯度試驗，對固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基進行初步優(yōu)化。

1.3.11 固態(tài)發(fā)酵條件的優(yōu)化

在原固態(tài)發(fā)酵條件下對發(fā)酵時間、接種量、p H值、料液比、裝料量5個因素進行單因素試驗，對固態(tài)發(fā)酵條件進行初步優(yōu)化。通過固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件的優(yōu)化試驗結(jié)果進行分析后，采用以五因素四水平的正交試驗來優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的配比和發(fā)酵條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 最適誘變劑量的選擇

圖1 紫外誘變時間對枯草芽孢桿菌致死率的影響Fig.1 Effect of UV irradiation time on the death rate of Bacillus subtilis K-6

由圖1可知，紫外線誘變時間與產(chǎn)異甘露聚糖酶的枯草芽孢桿菌菌株的致死率之間存在明顯的劑量效應關(guān)系。隨著紫外線誘變時間的延長，存活率逐漸降低。誘變誘變時間較長時致死率越高，一般致死率在90%以上時，其單位存活細胞中的正突變菌株較少，負突變菌株較多。但當致死率為80%～90%時，單位存活的細胞中正突變菌株較多[15]。當誘變時間為90s時其致死率為82.3%，因此選擇誘變時間為90s作為誘變劑量。

2.2 誘變菌株的初篩與復篩

通過初篩選擇H/C相對較大的15株菌株通過DNS法進一步復篩，以異甘露聚糖酶出發(fā)菌株編號為K-6-0為對照，測定發(fā)酵液的異甘露聚糖酶活力。突變菌株4號酶活力最高為264.5U/mL，比出發(fā)菌株的酶活提高了28.4%，所以選擇4號突變菌株為第2次紫外誘變的出發(fā)菌株，以后的每一次誘變?nèi)缜笆霾襟E，經(jīng)11次紫外誘變后得到一株酶活力最高的突變菌株9號，其酶活力為349.3U/mL，高于出發(fā)菌株69.6%，將其命名為枯草芽孢桿菌K-6-9。

2.3 遺傳穩(wěn)定性

表1 突變菌株穩(wěn)定性的研究Table 1 Genetic stability of strain K-6-9

對紫外誘變得到的異甘露聚糖酶活力最高的K-6-9突變株進行了遺傳穩(wěn)定性研究，將K-6-9突變株連續(xù)5代發(fā)酵，每傳一代均接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵48h后測定酶活力。由表1可知，產(chǎn)異甘露聚糖酶菌株K-6-9突變株連續(xù)5代發(fā)酵后，酶活力范圍為343.0～350.3U/mL，具有較好的遺傳穩(wěn)定性。

2.4 突變株K-6-9固態(tài)培養(yǎng)基和發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.4.1 自制酵母細胞壁添加量對產(chǎn)酶的影響

圖2 酵母細胞壁添加量對產(chǎn)酶的影響Fig.2 Effect of yeast wall amount on the production of isomannanase

異甘露聚糖酶是一種誘導酶，研究表明酵母細胞壁中含有大量的異甘露聚糖，對異甘露聚糖酶具有較強的誘導作用。選用麩皮作為碳源，在固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基上加入2%、4%、6%、8%、10%、12%不同質(zhì)量分數(shù)的自制酵母細胞壁，以2%的接種量將種子液接入固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中混勻，37℃發(fā)酵72h后測定酶活力，結(jié)果如圖2所示。加入8%自制酵母細胞壁量時酶活力最高。酵母細胞壁對產(chǎn)酶有誘導作用，還作為碳源為菌株的生長提供能量，所以并不是碳源濃度越高對菌株的生長越有利，培養(yǎng)基中的碳源濃度過高也會導致細胞脫水而使代謝產(chǎn)物降低[16]。

2.4.2 氮源對產(chǎn)酶的影響

選擇6種氮源，其添加量占固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的1%，以不添加氮源的為對照組。酵母細胞壁添加量8%，培養(yǎng)基其余成分不變，以2%的接種量將種子液接入到固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，混勻后置37℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵72h后測定酶活力，結(jié)果如圖3所示。利用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析得知6種氮源對產(chǎn)酶量均有顯著差異(P＜0.05)，從而選取添加后其酶活力最高的氯化銨做后續(xù)實驗。

圖3 氮源對產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effect of inorganic nitrogen sources on the production of isomannanase

2.4.3 裝料量對產(chǎn)酶的影響

氯化銨添加量5%、接種量2%，其余同初始固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基。將15、20、25、30g固態(tài)培養(yǎng)基分別裝入250mL三角瓶中，37℃靜置發(fā)酵72h，固態(tài)發(fā)酵過程中，由于單位體積的固態(tài)培養(yǎng)基的堆積和高菌體濃度會促使微生物代謝產(chǎn)生了大量的熱量無法及時傳遞，而導致固態(tài)培養(yǎng)基中溫度的上升，需考慮調(diào)節(jié)裝料量使其盡量達到菌體的最佳生長狀況及最佳的產(chǎn)酶效果。

圖4 裝料量對產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effect of medium loading amount on the production of isomannanase

由圖4可知，在裝料量為25g/250mL時枯草芽孢桿菌酶活力最高，隨著裝料量的增加其酶活力迅速下降，說明固態(tài)培養(yǎng)基過多堆積使溫度上升，不適宜菌體的生長及酶的產(chǎn)生。

2.4.4 料液比對產(chǎn)酶的影響

培養(yǎng)基中水分含量對菌體的生長有很大的影響。培養(yǎng)基中的料水比應適中，水分太高會使麩皮成團，影響培養(yǎng)基的透氣性與散熱性，水分太低會影響培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的溶解和傳遞[17]，也不能滿足菌體生長對水分的需求。固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基裝料量25g/250mL、酵母細胞壁添加量8%、接種量2%，改變料液比分別為1:0.6、1:0.8、1:1.0、1:1.2、1:1.4、1:1.6，混勻后置37℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵72h后測定酶活力，結(jié)果如圖5所示，料液比為1:1.0時酶活力最高，對產(chǎn)酶最有利。

圖5 料液比對產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effect of material-to-liquid ratio on the production of isomannanase

2.4.5 接種量對產(chǎn)酶的影響

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的料液比為1:1，其他組成及發(fā)酵條件不變，分別以1%、2%、3%、4%、5%的接種量將液態(tài)種子液接入到固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，混勻后37℃發(fā)酵72h后測定酶活力，結(jié)果如圖6所示，當接種量為3%時酶活力最高。因為接種量過低會導致菌體生長緩慢，發(fā)酵周期延長；而過高則影響菌體生長過快，造成溫度升高過快從而影響酶的產(chǎn)生。

圖6 接種量對產(chǎn)酶的影響Fig.6 Effect of inoculum amount on the production of isomannanase

2.4.6 初始pH值對產(chǎn)酶的影響

將固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基分別用1mol/L的HCl和NaOH調(diào)至pH值為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，高壓滅菌后，以3%接種量將種子液接入到固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，混勻后置37℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵72h后測定酶活力，結(jié)果如圖7所示。當pH7.0時酶活力最高，因此在pH7.0時最適宜菌體的生長及酶的產(chǎn)生。

圖7 pH值對產(chǎn)酶的影響Fig.7 Effect of pH on the production of isomannanase

2.4.7 發(fā)酵溫度和時間對產(chǎn)酶的影響

溫度不僅會影響菌體的生長、繁殖和新陳代謝，也會影響酶的產(chǎn)生及活性。菌體在生長繁殖期的對數(shù)期時其代謝活動最旺盛，最利于酶的產(chǎn)生，因此要考慮發(fā)酵時間，使其達到最佳的產(chǎn)酶時間。在32、34、36、38℃條件下，分別用優(yōu)化后的培養(yǎng)基組分和發(fā)酵條件進行發(fā)酵，發(fā)酵24、36、48、60、72、84、96、108h分別取樣，測定其酶活力，結(jié)果如圖8所示。在36℃發(fā)酵其酶活力最高，說明溫度偏低會使酶活力受到抑制[16]，細胞的新陳代謝活動減弱。隨著發(fā)酵時間的增加其產(chǎn)酶量也隨之增加，當發(fā)酵至72h后隨著時間的增加產(chǎn)酶量有緩慢降低的趨勢，有可能是因為發(fā)酵時間較長培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)完全消耗，菌體可以利用產(chǎn)生的酶可以作為碳源維持自身的需要，所以后期隨著時間的增加產(chǎn)酶量減少。因此選擇72h作為最佳發(fā)酵時間。

圖8 發(fā)酵溫度和時間對產(chǎn)酶的影響Fig.8 Effect of fermentation temperature and time on production of isomannanase

2.4.8 正交試驗結(jié)果

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，確定了裝料量為25g/250mL，無機氮源選取了氯化銨，剩余的5個因素設(shè)計按表2，以異甘露聚糖酶活力為指標，進行表2所示的L16(45)正交試驗。

表2 L16(45)正交試驗分析結(jié)果Table 2 L16(45) orthogonal array design arrangement and corresponding experimental results

由表2可知，正交試驗16組中得出的最優(yōu)工藝組合為第12組。在此條件下，菌株產(chǎn)生的酶活力可達576.4U/mL。根據(jù)正交試驗結(jié)果極差分析得到發(fā)酵時間對菌株的產(chǎn)酶能力影響最大，5個因素對菌株產(chǎn)酶能力影響強度大小為：A＞C＞D＞E＞B，即發(fā)酵時間＞pH值＞酵母細胞壁添加量＞料液比＞接種量。菌株產(chǎn)酶的最優(yōu)組合條件是：A3B3C3D2E3，即發(fā)酵時間為72h、接種量為3%、pH值為7.5、酵母細胞壁添加量8%、料液比為1:1.2。由于最優(yōu)組合并未出現(xiàn)在16組試驗中，所以需要進行驗證實驗。

經(jīng)實驗驗證最優(yōu)組合A3B3C3D2E3獲得的酶活力為601.6U/mL，高于正交試驗中出現(xiàn)的最高值576.4U/mL，所以選擇A3B3C3D2E3為最終發(fā)酵工藝條件。

3 結(jié) 論

產(chǎn)異甘露聚糖酶菌株在紫外線照射90s時致死率為82.3%，因此選擇誘變時間為90s作為誘變劑量。經(jīng)11次紫外誘變后通過初篩和復篩得到一株異甘露聚糖酶突變菌株K-6-9酶活最高為349.3U/mL，高于出發(fā)菌株69.6%。

經(jīng)單因素試驗和正交試驗優(yōu)化異甘露聚糖酶突變菌株K-6-9的固態(tài)發(fā)酵工藝條件，得出產(chǎn)酶的最適宜發(fā)酵條件為：pH7.5、裝液量25g/250mL、料液比為1:1.2、接種量為3%、發(fā)酵72h后測酶活力為601.6U/mL。

現(xiàn)文獻只有關(guān)于對β-甘露聚糖酶誘變育種及其固態(tài)發(fā)酵的報道[18]，異甘露聚糖酶的誘變育種及固態(tài)發(fā)酵條件的研究未見詳細報道。本研究固態(tài)發(fā)酵具有成本低廉、工藝簡單、操作粗放、能耗低、零污染等優(yōu)點，具有較好的工業(yè)化生產(chǎn)潛力。

[1] SCHOMBUG D, SALZMANN M. Eyzyme hand book[M]. Springer Verlag Berlin Heideberg, 1991: 1-5.

[2] AKINO T, NAKAMURA N, HORIKOSH K. Production ofβmannosidase andβ-mannanase by an alkalophilicBacillussp. [J]. Appl Microbio Biotechnol, 1987, 26(4): 323-327.

[3] 張聞, 汪立平, 汪之和, 等. 甘露聚糖酶產(chǎn)生菌F1-5的鑒定及發(fā)酵條件的研究[J]. 食品科學, 2009, 30(21): 288-293.

[4] 李自金, 邱波, 童運彬. 啤酒酵母取代魚粉在草魚上的應用[J]. 飼料工業(yè), 2009, 30(20): 25-26.

[5] WALDROUP A L, SKINNER J T, HIERHOLZER R E, et al. An evaluation of fructooligosaccharide in diets for broiler chickens and effects on salmonellae contamination of carcasses[J]. Poultry Sci, 1993, 72: 643-650.

[6] SHAFEY T M, AL MUFAREJ S, SHALABY M J, et al. The effect of feeding mannan-oligsaccharides(Bio-MOS) on the performance of meat chickens under two different vaccination programs[J]. Asian Aust J Anim Sci, 2001, 14(4): 559-563.

[7] 潘俊福, 徐春厚.β-甘露聚糖酶的營養(yǎng)免疫功能及其在動物生產(chǎn)中的應用[J]. 湖南飼料, 2007(4): 19-21.

[8] 張力華, 黃代勇, 王衛(wèi)華. 甘露低聚糖對小鼠腸道菌群的調(diào)節(jié)作用[J]. 中國中西醫(yī)結(jié)合消化雜志, 2006, 14(6): 380-381.

[9] 徐軍發(fā), 侯敢, 黃迪南, 等. 酵母多糖對小鼠腹腔巨噬細胞產(chǎn)生一氧化氮和白細胞介素-1的影響[J]. 中國生化藥物雜志, 2002, 23(2): 67-68.

[10] 趙芳芳, 張日俊. 酵母細胞壁生理功能及其應用[J]. 中國飼料, 2003(17): 17-18.

[11] 徐慧, 劉建軍, 趙祥穎. 淺談啤酒廢酵母的綜合利用[J]. 釀酒, 2008,35(1): 47-49.

[12] 馬相杰, 汪立平, 冷向軍, 等.β-甘露聚糖酶水解酵母細胞壁水解條件的研究[J]. 食品科技, 2009, 34(2): 7-10.

[13] 諸葛健, 王正祥. 工業(yè)微生物實驗技術(shù)手冊[M]. 北京: 中國輕工業(yè)出版社, 1994.

[14] 楊先芹, 孫丹, 楊文博, 等. 地衣芽孢桿菌NK-27菌株的產(chǎn)酶條件和粗酶性質(zhì)的研究[J]. 南開大學學報, 2002, 35(2): 117-120.

[15] 常旭虹, 趙廣才, 張雯, 等. 作物殘茬對農(nóng)田土壤風蝕的影響[J]. 水土保持學報, 2005, 19(1): 28-31.

[16] 楊清香, 曹軍衛(wèi). 嗜堿芽孢桿菌NTT33產(chǎn)堿性β-甘露聚糖酶發(fā)酵條件的研究及高產(chǎn)菌株選育[J]. 氨基酸和生物資源, 1998, 20(4): 14-18.

[17] 陳士成, 曲音波, 高培基. 芽孢桿菌A-30產(chǎn)堿性β-1,4-聚糖酶固體發(fā)酵研究[J]. 微生物學通報, 2000, 27(3): 188-191.

[18] 朱劼, 鄔敏辰. 酸性β-甘露聚糖酶的固態(tài)發(fā)酵和一般特性[J]. 生物技術(shù), 2003, 13(2): 30-32.

Optimization of Mutation Breeding and Solid-State Fermentation Conditions for Isomannanase-Producing Strain

MU Zhao-yan1，WANG Li-ping1,*，ZHANG Da-bing2，LI An-xue1，WANG Xin1
(1. College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China；2. School of Life and Technology, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China)

In order to improve the activity of isomannanase,Bacillus subtilisK-6, a strain capable of secreting isomannanase,was subjected to mutation breeding through UV induction. A positive mutant strain was obtained and fermentation conditions for the production of isomannanase by it were optimized by one-factor-at-a-time and orthogonal array design methods. The isomannanase activity of the original strain was 206.0 U/mL, while that of the high-yield mutant strain K-6-9 was 349.3 U/mL,showing a 69.6% increase compared withBacillus subtilisK-6. The isomannanase activity of the fifth generation of K-6-9 varied from 343.0～350.3 U/mL, indicating good genetic stability. The optimal fermentation conditions for isomannanase production by K-6-9 were found as 72 h of fermentation time, 3% of inoculum size, initial pH 7.5, and 25 g/250 mL of medium filling percentage.The optimal fermentation medium was composed of 40% wheat bran, 8% yeast wall and material-to-liquid ratio 1:1.2.The maximum activity of K-6-9 strain reached up to 601.6 U/mL under the optimal fermentation conditions.

isomannanase；UV mutation；solid-state fermentation

TS201.3

A

1002-6630(2012)15-0220-06

2011-06-29

上海市教育委員會重點學科建設(shè)項目(J50704)；上海市教育委員會重點創(chuàng)新項目(07ZZ137)

穆昭艷(1986—)，女，碩士，研究方向為食品微生物。E-mail：muzhaoyan0501@126.com

*通信作者：汪立平(1968—)，女，副教授，博士，研究方向為功能性寡糖、釀酒科學與技術(shù)及大豆精深加工。E-mail：lpwang@shou.edu.cn