樺褐孔菌子實體與菌絲體三萜化合物提取及活性比較研究

朱春玉，鄭方亮，邵麗杰，馮華煒，郭立雄，劉宏生*

(遼寧大學生命科學院，遼寧省生物大分子計算模擬與信息處理工程研究中心，遼寧省動物資源與疫病防治重點實驗室，遼寧 沈陽 110036)

樺褐孔菌子實體與菌絲體三萜化合物提取及活性比較研究

朱春玉，鄭方亮，邵麗杰，馮華煒，郭立雄，劉宏生*

(遼寧大學生命科學院，遼寧省生物大分子計算模擬與信息處理工程研究中心，遼寧省動物資源與疫病防治重點實驗室，遼寧 沈陽 110036)

為探索樺褐孔菌菌絲體與子實體在藥用價值上是否存在差別，采用有機溶劑冷浸、超聲回流法提取樺褐孔菌菌絲體及子實體的三萜化合物，通過薄層層析和紅外光譜分析，確定兩種來源的三萜化合物是相同或近似的同系物。四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)和杯碟法測定兩種來源三萜化合物對癌細胞和細菌的抑制作用，菌絲體三萜化合物對人胃癌細胞株MGC-803的最高抑制率可達到38.27%。結果證實人工培養的樺褐孔菌菌絲體同樣具有子實體的藥用價值，為人工培養樺褐孔菌菌絲體提供了依據。

樺褐孔菌；三萜化合物；抗腫瘤；抑菌活性

樺褐孔菌(Inonotus obliquus)屬于真菌門、擔子菌亞門、層菌綱、非褐菌目(無褐菌目)、多孔菌科、褐臥孔菌屬(纖孔菌屬)。中文名為白樺茸、黑樺菌、樺菌、斜管纖孔菌，被贊譽為“西伯利亞靈芝”[1]。

樺褐孔菌是一種耐寒的高等食藥用真菌，主要分布在北緯45°～50°的地區，樺褐孔菌子實體寄生于白樺、銀樺、赤楊等的樹干或樹皮下，形成木腐菌[2]。以往實驗對樺褐孔菌的研究表明它不僅對癌癥、糖尿病有很好的治療效果，并且具有增強機體免疫能力和抗輻射抗氧化等功效[3-4]。但樺褐孔菌子實體只有在活的樺木上生長10～15年才具有較高的藥用價值，且平均每2萬棵樺木中只有一棵生長樺褐孔菌，資源十分稀少[5]。鑒于樺褐孔菌的藥用價值和資源現狀，人工培養的菌絲體具有巨大的潛在價值，對于菌絲體與子實體藥用價值的區別備受關注。本實驗以采自長白山的樺褐孔菌子實體及其人工培養的菌絲體為原材料，采用有機溶劑冷浸、超聲回流提取法提取樺褐孔菌菌絲體及子實體三萜化合物，對提取的三萜化合物的抗腫瘤和抑菌活性進行比較，旨在為樺褐孔菌菌絲體內三萜類物質的深入研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樺褐孔菌LNUF008菌株由實驗室分離保存。中國典型培養物保藏中心保藏，編號為CCTCC M209280。大腸埃希式桿菌(Escherichia coli)、蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)由本實驗室提供。人胃癌癌細胞株MGC-803，由遼寧大學陳長蘭教授惠贈。

白樺脂醇標準品(純度為98%) 杭州天草公司；胰蛋白酶、新生小牛血清、Eagle培養基(由Dulbecco改良，DMEM) 美國Gibco公司；RPMI-1640 美國HyClone公司；臺盼藍、青霉素G鈉鹽、二甲基亞砜(D M S O)、石油醚、氯仿、香草醛、噻唑藍、溴化鉀、濃硫酸、高氯酸、冰乙酸、乙酸乙酯、甲醇、無水乙醇等均為國產試劑純。

1.2 儀器與設備

DNP-9802電熱恒溫培養箱 上海精宏實驗設備有限公司；RE52CS-2旋轉蒸發器、B-260恒溫水浴鍋 上海亞榮生化儀器廠；SHZ-DⅢ予華牌循環水真空泵 鞏義市硬峪予華儀器廠；KQ22DB數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；BB15CO2培養箱 德國Heraeus公司；Multiskan MK3酶標儀 美國Thermo Labsystems公司。

1.3 方法

1.3.1 三萜化合物提取

采用有機溶劑冷浸、超聲回流法提取樺褐孔菌體內三萜化合物[6-7]，取已收集的樺褐孔菌菌絲體干粉及子實體干粉10g，無水乙醇冷浸24h后，超聲回流提取，提取溫度為50℃，超聲時間1h后，5000r/min離心10min，收集上清液，減壓濃縮至干，得到粗三萜化合物，觀察其外部形態。稱量殘渣計算粗三萜化合物回收率。

1.3.2 三萜化合物含量測定

采用分光光度法測定樺褐孔菌三萜化合物的含量，以白樺脂醇標準品作為對照[8]。

標準曲線的制作：精確吸取以無水乙醇溶解的白樺脂醇。對照品標準溶液(0.016mg/mL)0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.55mL，分別置于5mL容量瓶，在100℃水浴上蒸干后加入0.20mL新制的5g/100mL香草醛-冰乙酸溶液和0.80mL高氯酸搖勻，于70℃水浴保溫反應15min后流水冷卻至室溫，再加入乙酸乙酯定量到5mL，搖勻，同時作試劑空白，以試劑空白對照和不同質量濃度水平白樺脂醇對照品溶液分別在400～900nm波長范圍內掃描，確定對照品的最大吸收波長為551nm。在551nm波長處以試劑空白為參比，用1cm比色皿測定體系在551nm處的吸光度[9]。以白樺脂醇的毫克數為橫坐標，A551nm為縱坐標，建立標準曲線。

三萜化合物含量測定：取適量備用的三萜化合物溶液，按上述操作并在551nm波長處測定吸光度。根據標準曲線計算三萜化合物的含量[10]。

1.3.3 兩種來源的樺褐孔菌三萜化合物的薄層層析

將回流提取得到的樺褐孔菌子實體內三萜化合物及菌絲體內三萜化合物分別點樣于硅膠層析板上，距端點2～3cm。置于層析缸中，室溫展開，取出吹干，噴顯色劑，置于烘箱中加熱，顯色。展層劑：氯仿、乙酸乙酯、乙醚體積比為9:1:1，顯色劑：濃硫酸、甲醇體積比為1:1，通過斑點的顏色及位置比較兩種粗三萜化合物的組成成分的異同。

1.3.4 兩種來源的樺褐孔菌三萜化合物的紅外光譜分析

取1～2mg樺褐孔菌三萜化合物樣品在瑪瑙研缽中，研磨成細粉末與干燥的溴化鉀粉末(約100mg，粒度200目)混合均勻，裝入模具內，在壓片機上壓制成片測試。把制備好的樣品放入樣品架，然后插入儀器樣品室的固定位置上，按儀器的操作流程測定。

將樺褐孔菌子實體體內三萜化合物的紅外圖譜及菌絲體體內三萜化合物的紅外圖譜相對比，從待測化合物的紅外光譜特征吸收頻率及紅外特性吸收譜帶的出現來確定兩種來源的三萜化合物的紅外光譜是否一致，如果兩者光譜吸收峰位置和相對強度基本一致時，可判定待測化合物是相同或近似的同系物。

1.3.5 兩種來源的樺褐孔菌三萜化合物的抗癌作用分析

所用癌細胞為胃癌MGC-803。以白樺脂醇為陽性對照通過MTT比色分析法[7]測定樺褐孔菌三萜化合物對癌細胞生長抑制作用。用胰蛋白酶消化匯合的單層細胞，將細胞稀釋至1×104CFU/mL，用加樣器在平底96孔板中的各孔中加入200μL細胞懸液，于37℃、5% CO2細胞培養箱中溫育24h。將各樣品稀釋5個濃度，做平行實驗，每個濃度3次重復，加入孔中。培養68h后每孔中各加入50μL MTT，繼續溫育4h，離心棄去培養基和MTT，每孔中各加入200μL DMSO，振蕩以溶解殘留的MTT-甲臜結晶。利用酶標儀測吸光度，計算細胞增殖率。

用胰蛋白酶消化長勢良好的單層細胞，吹打成均勻的細胞懸液，平均轉入3個細胞培養瓶(A、B、C)中。在培養瓶A中加入新鮮DMEM細胞培養基，培養瓶B中加入新鮮DMEM培養基及樺褐孔菌子實體粗三萜化合物至質量濃度為0.08mg/mL，培養瓶C中加入新鮮DMEM培養基及樺褐孔菌菌絲體粗三萜化合物至質量濃度為0.08mg/mL。于37℃、5% CO2細胞培養箱中溫育24h，倒置顯微鏡下觀察細胞長勢[11]。

1.3.6 兩種來源樺褐孔菌三萜化合物的抑菌作用

抑菌實驗方法采用管碟法，混菌平板制好后，用無菌鑷子取無菌牛津杯置于混菌平板上，杯中加滿試樣，細菌在37℃恒溫培養箱培養24h后，測量抑菌圈的直徑。試樣分別為各200μL的樺褐孔菌液體發酵液、樺褐孔菌三萜化合物、子實體三萜化合物，甲醇試劑對照。37℃恒溫培養箱培養過夜，24h后觀察抑菌實驗結果，用十字交叉法測量抑菌圈的直徑[12]。

2 結果與分析

2.1 樺褐孔菌三萜化合物的含量測定及形態觀察

樺褐孔菌三萜化合物的標準曲線回歸方程為y＝1.45180.0967(R2＝0.9945)。計算提取液的樺褐孔菌菌絲體三萜化合物為93.85mg/g，比子實體中的略高。觀察并記錄子實體及菌絲體三萜化合物顏色、結晶狀態、黏稠度等外部形態，記錄如表1所示。

表1 樺褐孔菌三萜化合物比較分析Table 1 Comparative analysis of triterpenoids from cultured mycelia and fruit bodies of Inonotus obliquus

2.2 兩種來源的樺褐孔菌三萜化合物的薄層層析結果

圖1 樺褐孔菌子實體與菌絲體三萜化合物TLC結果Fig.1 TLC results of triterpenoids from cultured mycelia and fruit bodies of Inonotus obliquus

將氯仿回流提取得到的樺褐孔菌子實體內三萜化合物及菌絲體內三萜化合物分別點樣于硅膠層析板上，展層后顯色，結果如圖1所示。樺褐孔菌子實體及菌絲體內三萜化合物經薄層層析(TLC)顯色后，斑點顏色及Rf值基本一致，初步證明利用氯仿冷浸超聲提取法所得三萜類化合物組成成分基本相同。

2.3 兩種來源的樺褐孔菌三萜化合物紅外光譜分析

圖2 樺褐孔菌體內三萜化合物紅外光譜圖對比分析Fig. 2 Infrared spectral analysis of triterpenoids from cultured mycelia and fruit bodies of Inonotus obliquus

由圖2可知，樺褐孔菌菌絲體及子實體內三萜化合物光譜吸收峰位置和相對強度基本一致，兩種來源三萜類物質的紅外光譜圖都在3050～3057cm-1有烯烴C－H伸縮吸收峰，1060～1070cm-1有羥基吸收峰，1704～721cm-1出現五元環酮的吸收峰等三萜類物質的特征峰并且吸收頻率相差不大，由此可判定兩種三萜化合物是相同或近似的同系物。

2.4 兩種來源的樺褐孔菌三萜化合物抗癌作用分析

采用MTT比色分析法，通過對樺褐孔菌子實體三萜化合物與菌絲體三萜化合物對胃癌MGC-803細胞增殖作用的抑制率的測定，兩種三萜化合物的對比關系如圖3所示。

圖3 樺褐孔菌三萜化合物抑制胃癌細胞MGC-803增殖效果對比Fig. 3 Comparison of inhibitory effects of triterpenoids from cultured mycelia and fruit bodies of Inonotus obliquus on the proliferation of gastric cancer cell MGC-803

由圖3可知，樺褐孔菌子實體及菌絲體內三萜化合物對胃癌MGC-803細胞增殖均具有抑制作用。兩種三萜化合物的抑制率隨著質量濃度的升高顯著上升，當三萜化合物的質量濃度達到0.16mg/mL后，隨著質量濃度的升高上升速度逐漸緩慢。當質量濃度到達0.32mg/mL菌絲體和子實體三萜化合物對胃癌細胞抑制率分別為(38.3±2.3)%和(28.4±1.9)%，根據統計學原理，采用統計學軟件SPSS 17.0處理，組間比較采用t檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義，P＜0.01表示差異極顯著，檢驗結果表明樺褐孔菌菌絲體和子實體三萜化合物對胃癌細胞抑制率的差異極顯著(P＝0.002)，其中菌絲體三萜化合物抑制率更高。對照組白樺脂醇的抑制效果明顯低于實驗組，這可能由于多種三萜類化合物的協同抑癌效果優于單一的三萜化合物白樺脂醇的抑癌效果。

圖4 樺褐孔菌三萜化合物抑制胃癌細胞MGC-803顯微觀察圖Fig.4 Microscopic images of gastric cancer cell MGC-803 suppressed by triterpenoids from Inonotus obliquus

將正常細胞及加藥細胞于細胞培養箱中培養24h，在倒置顯微鏡下觀察細胞長勢。由圖4可知，加藥細胞明顯增殖速度緩慢，細胞壁皺縮，細胞小，胞質突起，細胞器完整，胞膜完整。據細胞形態初步判斷，樺褐孔菌三萜化合物可能是通過誘導細胞凋亡，以抑制癌細胞生長。由實驗可知，樺褐孔菌菌絲體三萜化合物對癌細胞生長抑制能力高于子實體內三萜化合物。

2.5 兩種來源的樺褐孔菌三萜化合物的抑菌活性研究

表2 樺褐孔菌三萜化合物對4種細菌的抑制效果Table 2 Inhibitory effects of triterpenoids from cultured mycelia and fruit bodies of Inonotus obliquus on four species of bacteria

由表2可知，樺褐孔菌三萜化合物對蠟狀芽孢桿菌(B.cereus)的抑菌效果具有差異性，對其他3種細菌的抑菌效果具有顯著性，組間比較對大腸桿菌(E.coli)和金黃色葡萄球菌(S.aureus)的抑制效果差異不顯著，說明樺褐孔菌三萜化合物對大腸桿菌(E.coli)和金黃色葡萄球菌(S.aureus)的抑制效果相差不大，對枯草芽孢桿菌(B.cubtilis)的抑制效果同其他3種細菌相比較最差，抑菌圈直徑僅為11.76mm，對蠟狀芽孢桿菌(B.cereus)的抑制效果最為顯著，抑菌圈直徑為24.67mm。實驗顯示樺褐孔菌子實體與菌絲體中的三萜化合物的抑菌效果相當，沒有明顯區別。

3 結論與討論

采用本實驗室優化的樺褐孔菌三萜化合物的提取方法，即用無水乙醇冷浸24h，50℃超聲回流提取1h，所得的樺褐孔菌三萜化合物產率最佳，提取的樺褐孔菌菌絲體三萜化合物可達到93.85mg/g，用乙醇作溶劑，避免使用其他有毒有害的試劑，降低了毒性。采用杯碟法測定樺褐孔菌菌絲體及子實體三萜化合物對大腸桿菌(E.coli)、金黃色葡萄球菌(S.aureus)、蠟狀芽孢桿菌(B.cereus)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)均有一定的抑制作用，其中對蠟狀芽孢桿菌(B.cereus)的抑制效果最為顯著，抑菌圈直徑為24.67mm。通過MTT比色法測定三萜化合物對人胃癌細胞株MGC-803的最高抑制率可達到38.27%，并且實驗證實樺褐孔菌菌絲體三萜化合物對癌細胞生長抑制能力高于子實體三萜化合物。

綜上所述，樺褐孔菌發酵菌絲體中的三萜化合物含量高、抗癌抗腫瘤功效顯著，優于子實體內三萜化合物。兩種來源的三萜化合物的抑菌活性差異不顯著。因此，利用樺褐孔菌的深層菌體發酵培養代替有限的野生子實體資源，生產三萜類活性物質合理可行，為樺褐孔菌產品的進一步開發提供了新的途徑。經過近幾年國內外的研究，特別是歐美國家，人們已經從樺褐孔菌中提取到多種有效成分，進行臨床實驗，證實樺褐孔菌具有很好治療糖尿病、防止高血壓、抗癌、抗衰老、有效抑制傳染性病毒等作用[4,13-15]。鑒于樺褐孔菌的開發應用前景，今后應進一步對樺褐孔菌進行更加深入系統的研究，開發研制樺褐孔菌系列保健醫藥食品[16-17]，使其為人類防病治病發揮更大的作用。

[1] 李建光, 司俊娜, 高愿軍. 樺褐孔菌研究綜述[J]. 安徽農業科學, 2008,36(2): 571-572; 582.

[2] HYUN K W, JEONG S C, LEE D H, et al. Isolation and characterization of a novel plateletag gregation inhibitory peptide from the medicinal mushroom,Inonotus obliquus[J]. Peptides, 2006, 27: 1173-1178.

[3] KIM Y O, HAN S B, LEE L W, et al. Immuno-stimulating effect of the endopolysaccharide produced by submerged culture ofInonotus obliquus[J]. Life Sciences, 2005, 77: 2438-2456.

[4] SONG Yana, HUI Jing, KOU Wei , et al. Identification ofInonotus obliquusand analysis of antioxidation and antitumor activities of polysaccharides[J]. Current Microbiology, 2008, 57(5): 454-462.

[5] 陳艷秋, 李玉. 樺褐孔茵的研究進展[J]. 微生物學通報, 2005, 32(2):124-127.

[6] 潘春麗, 查勇, 張鑫, 等. 樺褐孔菌三萜化合物提取工藝的優選[J].生物加工過程, 2008, 6(4): 36-39.

[7] 田明月, 俞力, 徐秀泉. 正交設計法優化樺褐孔菌總三萜超聲提取工藝[J]. 中國實驗方劑學雜志, 2011, 17(12): 31-33.

[8] 周俐斐, 蘆柏震, 侯桂蘭. 中藥三萜類化合物的提取分離及測定方法研究進展[J]. 中藥與天然藥物, 2007, 19(3): 62-65.

[9] 沈思, 李孚杰, 梅光明, 等. 茯苓皮三萜類物質含量的測定及其抑菌活性的研究[J]. 食品科學, 2009, 30(1): 95-98.

[10] 李 淼, 魯戰會, 孔曉玲, 等. 野生與人工栽培樺褐孔菌提取物抗糖基化終產物及降血壓活性比較[J]. 食品科技, 2010, 35(11): 198-202.

[11] 沈蕾. 細胞凋亡與腫瘤的關系[J]. 臨床兒科雜志, 2002, 20(l0): 638-640.

[12] 劉高強, 章春蓮, 彭廣生. 赤芝菌體中三萜抑菌作用研究[J]. 時珍國醫國藥, 2008, 19(11): 2578-2579.

[13] 李英秀, 崔基成, 孔東植. 樺褐孔菌提取物對胃癌MGC-803細胞株的抗增殖與誘導作用[J]. 菌物研究, 2003, 1(1): 17-23.

[14] 孫常松, 李瑪琳. 五環三萜類化合物抗腫瘤活性及其機制研究進展[J]. 中國民族民間醫藥, 2009, 18(12): 14-15.

[15] ZHENG Weifa, ZHANG Meimei, ZHAO Yanxia, et al. Accumulation of antioxidant phenolic constituents in submerged cultures ofInonotus obliquus[J]. Bioresource Technology, 2009, 100: 1327-1335.

[16] WASSER S P. Medicinal mushrooms as a source of antitumor and immunmodulating polysaccharrides[J]. Apple Microbool Biotechnol,2002, 60: 258.

[17] 盧丹, 劉金平, 李平亞. 三萜類化合物抗癌活性研究進展[J]. 特產研究, 2010, 1(1): 65-68.

Extraction and Bioactivity of Triterpenoids from Fruit Bodies and Mycelia ofInonotus obliquus

ZHU Chun-yu，ZHENG Fang-liang，SHAO Li-jie，FENG Hua-wei，GUO Li-xiong，LIU Hong-sheng*
(Key Laboratory of Animal Resource and Epidemic Disease Prevention, Research Center for Computer Simulating and Information Processing of Bio-Macromolecules of Liaoning, College of Life Science, Liaoning University, Shenyang 110036, China)

In order to explore the difference in medicinal value of cultured mycelia and fruit bodies ofInonotus obliquus, organic solvent cold soaking and ultrasonic reflux were adopted to extract triterpenoids from fruit bodies and mycelia ofInonotus obliquus. The triterpenoids extracted from both sources were determined to be the same or similar homologues by thin layer chromatography (TLC) and Fourier transform infrared (FT-IR) spectral analysis. Both triterpenoid extracts could inhibit the growth of cancer cells and bacteria as determined by tetrazolium salt assay (MTT) and cylinder plate method. The highest inhibitory rate of triterpenoids to human gastric cancer cell line MGC-803 reached up to 38.27%. Therefore cultured mycelia ofInonotus obliquushave the same medicinal value as fruit bodies.

Inonotus obliquus；triterpenes；anti-tumor activity；anti-bacterial activity

Q541

A

1002-6630(2012)15-0161-05

2011-09-28

遼寧省教育廳重點實驗室項目(2009S043)；遼寧大學青年科研基金項目(488020)

朱春玉(1978—)，女，副教授，博士，研究方向為資源微生物學及病毒學。E-mail：zhuchunyu@lnu.edu.cn

*通信作者: 劉宏生(1963—)，男，教授，博士，研究方向為資源微生物學及病毒學。E-mail：hongshengl@126.com