基因組改組快速提高谷氨酸棒桿菌L-鳥氨酸產量

張媛媛，李家洲

(1.廣東輕工職業技術學院食品與生物工程系，廣東 廣州 510300；2.中山大學生命科學學院，廣東 廣州 510300)

基因組改組快速提高谷氨酸棒桿菌L-鳥氨酸產量

張媛媛1,2，李家洲1

(1.廣東輕工職業技術學院食品與生物工程系，廣東 廣州 510300；2.中山大學生命科學學院，廣東 廣州 510300)

以谷氨酸棒桿菌ATCC13032為出發菌，應用基因組改組技術快速提高L-鳥氨酸產量。經過紫外線、亞硝基胍和甲基磺酸乙酯分別誘變處理，獲得6株產量有所提高的突變株，以此構建用于基因組改組的候選菌庫。考察培養基成分對原生質體再生率的影響。經過兩輪的滅活原生質體遞推式融合，以磺胺胍和氟化鈉為雙抗性篩選標記，共篩選出2株遺傳性能穩定的改組菌株。其中改組菌株F2-6搖瓶發酵72h，積累L-鳥氨酸產量為2.99g/L，是出發菌株的13.6倍。結果表明基因組改組技術能夠在短期內使谷氨酸棒桿菌的L-鳥氨酸產量得以提高。

基因組改組；谷氨酸棒桿菌；L-鳥氨酸；產量

L-鳥氨酸在生物體內主要參與尿素循環，對氨態氮的排出有重要作用[1]。近年來，L-鳥氨酸在醫藥和食品行業均有廣泛用途[2]。在醫藥工業，L-鳥氨酸除了主要用于保肝、護肝及治療高血氨癥外[3]，還可用于外傷和燒傷的恢復[4]；在食品行業，L-鳥氨酸既有保健減肥的功效又能提高機體免疫力，是健美者和運動員的理想營養補劑。L-鳥氨酸的多功能保健作用不斷引起人們的關注，其市場需求日益劇增。但L-鳥氨酸的生產較為困難，目前L-鳥氨酸的生產主要有酶法和發酵法。酶法是精氨酸在精氨酸酶的作用下，轉化生成L-鳥氨酸。此法雖然產品純度高，但精氨酸和精氨酸酶都難于獲得，導致生產成本過高[5]。而發酵法則簡單易行，特別適合于工業化生產。目前，應用于工業化生產的菌株大都是通過傳統誘變育種獲得，生產性能不穩定，給企業帶來較大的困擾。最近，國際上開始了L-鳥氨酸代謝工程方面的研究[6-8](從分子水平上構建L-鳥氨酸工程菌)并取得了一定的進展，但菌株基因組信息和代謝網絡信息的欠缺限制了研究者對L-鳥氨酸生產菌的進一步改造。

基因組改組技術是DNA改組技術在全基因組水平的延伸，可將多親本的優良基因整合在一起。自Zhang Yingxin等[9]首次提出該技術以來，該技術已成功應用于諸多研究中以提高代謝產物產量[10]，增強微生物對環境的耐受性[11-12]以及底物利用范圍[13]，甚至誘導微生物分泌新的代謝產物[14]等。基因組改組技術不僅具有篩選周期短、正突變率高、避免對誘變劑產生“鈍化”等優點，而且還將為功能基因組學的研究及揭示基因型和表型的關系提供素材[15]。本實驗以谷氨酸棒桿菌ATCC13032(其基因組序列已公布GI號為42602314)為出發菌，應用基因組改組技術快速提高其L-鳥氨酸產量，為探索谷氨酸棒桿菌產L-鳥氨酸的代謝機制及進一步構建L-鳥氨酸高產菌提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicumATCC 13032)，為本實驗室保存菌種。

1.1.2 試劑

L-鳥氨酸標準品(日本進口分裝) 上海伯奧生物科技有限公司；亞硝基胍(NTG) 美國Fluka公司；磺胺胍(SG)、甲基磺酸乙酯(EMS) 美國Sigma公司；其他試劑均為國產分析純。

1.1.3 培養基

完全培養基、種子培養基、發酵培養基和抗性篩選培養基參照文獻[16]。

再生培養基(g/L)：葡萄糖1、蛋白胨10、牛肉膏10、酵母粉5、NaC1 5、丁二酸鈉135、MgCl22，pH 7.0，上層培養基瓊脂粉質量濃度為8g/L，下層培養基瓊脂粉質量濃度為18g/L。

1.2 方法

1.2.1 菌種誘變方法

利用紫外線(UV)及NTG誘變，參照文獻[16]方法。

EMS誘變：取100μL EMS和9.9mL菌懸液于滅菌離心管中，200r/min作用30min，用等體積20g/L的硫代硫酸鈉終止反應。洗滌后，轉接入種子培養基中培養8h。梯度稀釋后分別取樣0.1mL均勻涂布于抗性篩選平板上，于32℃培養2～3d。

1.2.2 篩選方法

初篩：將抗性篩選培養基上生長良好的單菌落接入發酵培養基(250mL三角瓶裝液量30mL)中，32℃、200r/min振蕩培養72h，測發酵液中L-鳥氨酸產量。

復篩：將初篩產量較高的菌株，先接入種子培養基(250mL三角瓶裝液量 30mL)，32℃、200r/min振蕩培養12h，再按體積分數10%的接種量接入發酵培養基中32℃，200r/min振蕩培養72h，發酵結束后，測其發酵液中L-鳥氨酸產量。每次平行實驗3次。

1.2.3 原生質體的制備

取1環新鮮活化的谷氨酸棒桿菌，接入種子培養基中，30℃、150r/min振蕩培養24h；取1mL菌液于種子培養基中(250mL三角瓶裝液量 30mL)，培養3h，加入終濃度為0.6U/mL青霉素繼續培養3h，取上述培養的菌液10mL于4℃、4000r/min離心15min，去上清液，洗滌2次，再加入終質量濃度為1mg/mL的溶菌酶，于32℃處理2 h，洗滌后備用。

1.2.4 原生質體的再生和融合

原生質體的再生、融合及再生率的計算，參照文獻[17]方法進行。

1.2.5 基因組改組

將候選菌庫中的菌株都制備成原生質體，混合后分成兩等份，分別進行紫外滅活和55℃熱滅活。取滅活后的原生質體懸浮液各2.5mL于無菌試管中融合。融合后的菌液進行梯度稀釋，取0.2mL用夾層法培養于再生平板上，32℃培養至長出菌落。經初篩和復篩，所得L-鳥氨酸產量提高的幾株菌株，作為下一輪基因組改組的親本。

1.2.6 菌株遺傳穩定性的檢驗

將F2代菌株分別用新鮮的抗性篩選斜面培養基連續傳代6次，1～6代菌株一同進行搖瓶發酵，每代菌株平行發酵3次，于發酵72h測定L-鳥氨酸產量，比較每一代菌株的發酵結果，考察其遺傳穩定性。

1.2.7L-鳥氨酸產量及生物量的測定

參照文獻[8]方法。

2 結果與分析

2.1 候選菌庫的構建

圖1 候選菌庫中菌株的L-鳥氨酸產量Fig.1 L-Ornithine yield of the starting ATCC13032 strain and some mutants

選用SG和氟化鈉(NaF)為抗性篩選標記。在含0.5g/L SG和0.8g/L NaF抗性平板上，隨機挑選240株菌株進行初篩，再復篩，共獲得63株L-鳥氨酸產量有所提高的突變菌株。選取每種誘變劑誘變結果最好的2株菌株，共6株(N2、N5、U11、U48、E14和E30)構成候選菌庫。由圖1可知，此6株菌株的L-鳥氨酸平均產量為0.97g/L，約為出發菌株ATCC 13032產量(0.22g/L)的4.4倍。

2.2 再生培養基的優化

表1 DMSO和CaCl2的添加對谷氨酸棒桿菌ATCC 13032 原生質體再生率的影響Table 1 Effects of DMSO and CaCl2 in the medium on the regeneration rate of Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 protoplasts

向再生培養基添加不同量的DMSO和CaCl2，考察其對ATCC 13032 原生質體再生率的影響。由表1可知，DMSO和CaCl2的添加均可顯著提高原生質體再生率，當再生培養基中同時添加3g/L的CaCl2和10mL/L的DMSO時，原生質體再生率最高可達34%，較未添加時提高了1.125倍。

2.3 融合子的篩選

圖2 紫外線照射時間及55℃熱作用時間對谷氨酸棒桿菌原生質體致死率的影響Fig.2 Effects of UV irradiation and heating at 55 ℃ on the survival of Corynebacterium glutamicum protoplasts

將融合子的再生與抗性篩選分步操作(即原生質體融合后先再生，待長出菌落后再轉接于抗性平板上)，并同時采用多親本滅活法進一步提高篩選效率。由圖2可知，候選菌庫中菌株的原生質體致死率達100%時，需紫外線照射25min或55℃熱處理120min。多親本滅活法與原生質體再生、抗性篩選分步操作相結合，篩選產量提高的融合子的速度大為提高。

2.4 兩輪基因組改組菌株產L-鳥氨酸的比較

以候選菌庫中的6株菌株為出發菌株，進行第一輪改組。經誘變后的菌株獲得了新的遺傳性狀，耐受SG和 NaF的能力也發生了變化，因此抗性平板中這兩種物質的質量濃度也要隨之調整。第一輪改組后所用抗性平板中的SG和 NaF質量濃度分別提高至0.7g/L及1.0g/L(候選菌庫中的菌株在此質量濃度條件下均不能生長)。在此抗性平板上長出的菌落中隨機挑選80株菌株進行初篩，再復篩，得到L-鳥氨酸產量進一步提高的第一代改組菌株：F1-3、F1-8、F1-12、F1-23、F1-56、F1-77，其平均L-鳥氨酸產量達1.92g/L，比候選菌庫中菌株的平均產量提高96%，如圖3所示。以此為F1代6株菌株再次進行基因組改組，結果獲得4株產量有所提高的第二代改組菌株：F2-6、F2-21、F2-23、F2-29，其L-鳥氨酸產量(2.85g/L)比第一代改組菌株平均產量提高50%，其中F2-6產量最高達2.99g/L，是原始菌谷氨酸棒桿菌ATCC 13032L-鳥氨酸產量的13.6倍。

圖3 基因組改組菌與原始菌發酵產L-鳥氨酸的比較Fig.3 Comparison of L-ornithine yield between the starting wide-type strain and genome shuffled mutants

2.5 F2代改組菌的遺傳穩定性

為保證菌株在傳代過程中不受培養基的影響，本實驗以抗性篩選培養基為斜面培養基，將F2代4株菌株分別傳代至第6代，再同時進行L-鳥氨酸搖瓶發酵。由表2可知，F2-21和F2-23分別在傳至第3代及第4代出現突變，產量下降明顯。F2-6和F2-29產酸較穩定，其中F2-6產量最高，傳6代，平均產L-鳥氨酸為2.93g/L。可見，改組菌也有遺傳不穩定的可能。F2-6和F2-29遺傳穩定性好，可用于后續研究。

表2 F2代改組菌株的遺傳穩定性(±s，n＝3)Table 2 Results of genetic stability tests obtained for strains(± s，n ＝ 3)

表2 F2代改組菌株的遺傳穩定性(±s，n＝3)Table 2 Results of genetic stability tests obtained for strains(± s，n ＝ 3)

菌株 L-鳥氨酸產量/(g/L)第一代 第二代 第三代 第四代 第五代 第六代F2-6 2.99±0.15 2.88±0.23 3.02±0.22 2.91±0.082.89±0.12 2.88±0.19 F2-21 2.94±0.05 2.79±0.07 1.86±0.11 1.68±0.131.77±0.03 1.65±0.21 F2-23 2.75±0.08 2.85±0.11 2.78±0.04 1.55±0.061.43±0.05 1.26±0.11 F2-29 2.74±0.12 2.55±0.05 2.78±0.11 2.86±0.212.78±0.07 2.67±0.15

2.6 原始菌ATCC 13032與改組菌株F2-6、F2-29搖瓶發酵比較

將原始菌ATCC 13032、改組菌F2-6、F2-29的種子液分別接入發酵培養基中，測定搖瓶發酵72h過程中菌株生長及L-鳥氨酸生產情況。由圖4可知，發酵前期L-鳥氨酸的積累較慢，發酵24h后，3株菌株產酸速率加快，發酵72h時產酸量達到最高峰，且F2-6、F2-29，分別是其產量的13.6倍和12.5倍；改組菌F2-6與原始菌的生長曲線相似，均在發酵12h達到穩定期，F2-29則于發酵24h達到穩定期，其最終菌體濃度也大于前兩者，是原始菌的菌體濃度的115%。

圖4 原始菌ATCC 13032與改組菌F2-6、F2-29的搖瓶發酵曲線Fig.4 Growth curves and L-ornithine accumulation curves of strains ATCC 13032, F2-6 and F2-29 in shake-flask culture

3 討 論

谷氨酸棒桿菌ATCC 13032基因組序列的公布為探索L-鳥氨酸代謝機制提供了契機。基因組改組技術，不僅可快速改進細胞表型，而且還將在代謝工程及基因組學研究中發揮重要作用。本實驗以谷氨酸棒桿菌ATCC 13032為出發菌，通過兩輪基因組改組獲得2株性能穩定的L-鳥氨酸高產菌，其中F2-6產量最高為2.99g/L，是出發菌株的13.6倍，為本課題組探索谷氨酸棒桿菌的L-鳥氨酸代謝機制及后續研究奠定了基礎。目前，L-鳥氨酸代謝工程菌最高產量為3.295g/L[7](該生產菌株也是以ATCC 13032為出發菌，經改造而得)。通過兩輪基因組改組獲得的F2-6產量與之接近。

進行基因組改組首先需要構建一個候選菌庫，該菌庫中各正突變株的基因組之間差別越大，基因組改組后獲得表型有較大改進的雜交菌種的可能性就越大[18]。為擴大候選菌庫中菌株的遺傳背景的差異，采用3種高效誘變劑(NTG、UV、EMS)分別對谷氨酸棒桿菌ATCC 13032進行誘變。但如何高效篩選目的表型的突變株一直是誘變育種中的難點。擬選用合適的抗性標記，以加快菌種篩選進程。據報道具有SG抗性的突變株，L-鳥氨酸產量會有較大提高[19]；具有NaF抗性的菌株，L-谷氨酸(合成L-鳥氨酸的前體)產量也有望增加。因此，選用SG和NaF為抗性篩選標記。

研究過程中發現，采用常見的谷氨酸棒桿菌再生培養基[17]來再生ATCC 13032的原生質體，結果僅獲得了16%的再生率，導致獲得高產量融合子的概率偏低。DMSO能保護細胞膜的穩定性，增加細胞對營養物質的吸收；而鈣離子則能與細胞膜磷酯中一些負電荷相結合，增加細胞膜的穩定性和完整性[20]。DMSO和CaCl2的添加可提高谷氨酸棒桿菌原生質體的再生率，以保證高產改組菌能夠再生。

而對于融合子的篩選，先嘗試了將多親本的原生質體融合后直接用含有SG及NaF的再生培養基再生，但培養一周后仍未發現有菌落長出。這可能是原生質體再生和抗性標記的雙重壓力抑制了菌株的生長。因此，本實驗采用將融合子的再生與抗性篩選分步操作。

總之，構建遺傳背景差異較大的正突變菌庫，選用SG和NaF為雙抗性篩選標記，提高原生質體的再生率，采用多親本原生質體滅活法，是本研究在短時間內篩選出高產菌的關鍵。另外，谷氨酸棒桿菌是多種氨基酸的生產菌，本研究還將為其他氨基酸高產菌的選育及其代謝機制的探討提供借鑒。

[1] MORRIS S M. Regulation of enzymes of the urea cycle and arginine metabolism[J]. Annu Rev Nutr, 2002, 22: 87-105.

[2] 汪江波, 鄒玉玲, 薛海燕.L-鳥氨酸的生物功能及生產研究[J]. 食品研究與開發, 2007, 28(3): 166-169.

[3] JALAN R, WRIGHT G, DAVIES N A, et al.L-Ornithine phenylacetate(OP): a novel treatment for hyperammonemia and hepatic encephalopathy[J]. Med Hypotheses, 2007, 69: 1064-1069.

[4] SHI H P, FISHEL R S, EFRON D T, et al. Effect of supplemental ornithine on wound healing[J]. J Surg Res, 2002, 106: 299-302.

[5] GOTOH T, KIKUCHI K I, KAGAYA A. Direct production ofL-ornithine from casein by commercial digestive enzymes and in situ activated arginase[J]. Bioprocess Biosyst Eng, 2010, 33: 773-777.

[6] HWANG J H, HWANG G H, CHO J Y. Effect of increased glutamate availability onL-ornithine production inCorynebacterium glutamicum[J]. J Microbiol Biotechnol, 2008, 18(4): 704-710.

[7] LEE S Y, CHO J Y, LEE H J, et al. Enhancement of ornithine production in proline-supplementedCorynebacterium glutamicumby ornithine cyclodeaminase[J]. J Microbiol Biotechnol, 2010, 20(1): 127-131.

[8] LEE Y J, CHO J Y. Genetic manipulation of a primary metabolic pathway forL-ornithine production inEscherichia coli[J]. Biotechnol Lett, 2006, 28: 1849-1856.

[9] ZHANG Yingxin, PERRY K, VINCI V A, et al. Genome shuffling leads to rapid phenotypic improvement in bacteria[J]. Nature, 2002, 415: 644-646.

[10] KANG J X, CHEN X J, CHEN W R, et al. Enhanced production of pullulan inAureobasidium pullulansby a new process of genome shuffling[J]. Process Biochem, 2011, 46: 792-795.

[11] 于雷, 雷霆, 裴曉林, 等. 應用基因組改組選育耐糖L-乳酸高產菌[J]. 食品科學, 2007, 28(9): 369-373.

[12] 王立梅, 齊斌. 基因組改組技術對L-乳酸產生菌耐熱性的影響[J]. 食品科學, 2008, 29(10): 395-378.

[13] JOHN R P, GANGADHARAN D, NAMPOOTHIRI K M. Genome shuffling ofLactobacillus delbrueckiimutant andBacillus amyloliquefaciensthrough protoplasmic fusion forL-lactic acid production from starchy wastes[J]. Bioresource Technol, 2008, 99(17): 8008-8015.

[14] WANG Mingzi, LIU Shaosong, LI Yaoyao, et al. Protoplast mutation and genome shuffling induce the endophytic fungusTuberculariasp.TF5 to produce new compounds[J]. Curr Microbiol, 2010, 61: 254-260.

[15] ZHANG Ying, LIU Jianzhong, HUANG Junsheng, et al. Genome shuffling ofPropionibacterium shermaniifor improving vitamin B12 production and comparative proteome analysis[J]. J Biotechnol, 2010, 148:139-143.

[16] 張媛媛, 劉建忠, 江文明. 定向誘變谷氨酸棒桿菌13032產L-鳥氨酸的研究[J]. 現代食品科技, 2010, 26(12): 1330-1334.

[17] 張克旭, 陳寧, 張永志, 等. 用原生質體融合技術選育谷氨酸高產菌[J]. 微生物學報, 1991, 31(2): 108-114.

[18] 陳濤, 陳洵, 王靖宇, 等. DNA及基因組改組在代謝工程中的應用[J]. 化工學報, 2004, 55(11): 1753-1758.

[19] 鄒玉玲, 薛海燕, 汪江波, 等. 鈷60與紫外線復合誘變選育L-鳥氨酸高產菌株[J]. 華西藥學雜志, 2007, 22(3): 263-265.

[20] 王春平, 韋強, 鮑國連, 等. 微生物原生質體融合技術研究進展[J].動物醫學進展, 2008, 29(5): 64-67.

Genome Shuffling for Rapid Improvement ofL-Ornithine Production byCorynebacterium glutamicum

ZHANG Yuan-yuan1,2，LI Jia-zhou1
(1. Department of Food and Bioengineering, Guangdong Industry Technical College, Guangzhou 510300, China；2. School of Life Sciences, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510300, China)

Genome shuffling was applied toCorynebacterium glutamicumATCC13032 to achieve rapid improvement ofL-ornithine production. Six mutant strains with subtle improvements inL-ornithine production were obtained by treatment with UV light, nitrosoguanidine or ethyl methane sulfonate and subjected to recursive protoplast fusion. The effects of medium components on the protoplast regeneration rate were investigated. High-yield strains were screened using plates containing different concentrations of sulfaguanidine and NaF. After two rounds of genome shuffling, two shuffled strains producingL-ornithine at high level with good genetic stability were selected and named as F2-6 and F2-29. After 72h of shake-flask fermentation, theL-ornithine yield of strain F2-6 reached 2.99 g/L, which was 13.6 times higher than that of the original strain.

genome shuffling；Corynebacterium glutamicum；L-ornithine；production

Q939.97

A

1002-6630(2012)15-0206-04

2011-08-22

國家自然科學基金面上項目(20876181)

張媛媛(1979—)，女，講師，博士研究生，研究方向為代謝工程。E-mail：merryyuan8044@sina.com