微生物發酵法制取葡萄皮渣膳食纖維的工藝優化

令 博，田云波，吳洪斌，明 建,3,*

(1.西南大學食品科學學院，重慶 400715；2.新疆農墾科學院農產品加工研究所，新疆 石河子 832000；3.重慶市特色食品工程技術研究中心，重慶 400715)

微生物發酵法制取葡萄皮渣膳食纖維的工藝優化

令 博1，田云波1，吳洪斌2，明 建1,3,*

(1.西南大學食品科學學院，重慶 400715；2.新疆農墾科學院農產品加工研究所，新疆 石河子 832000；3.重慶市特色食品工程技術研究中心，重慶 400715)

以釀酒葡萄皮渣為原料，采用保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌混合菌為發酵菌種，以發酵溫度、發酵時間、接種量及料液比對水溶性膳食纖維(SDF)得率的影響為考察指標，通過單因素試驗和均勻試驗優化微生物發酵法制取葡萄皮渣膳食纖維的工藝。結果顯示：發酵法制取葡萄皮渣膳食纖維的最佳工藝條件為：發酵溫度40℃、發酵時間21h、接種量1%、料液比1:10，在此條件下得到SDF產率為(17.25±0.23)%，所制葡萄皮渣膳食纖維素的膨脹力、持水力和持油力分別為3.38mL/g、4.32g/g和1.87g/g，與原料相比膳食纖維的純度和理化性質均得到一定提高。微生物發酵法制備膳食纖維的同時能有效提高其品質指標，是一種較好的高品質膳食纖維制備方法。

葡萄皮渣；膳食纖維；發酵法

葡萄是僅次于柑橘的世界第二大水果，葡萄皮渣(grape pomace，GP)即葡萄經釀酒后產生的殘渣，主要由葡萄皮和葡萄籽組成，約占其總加工質量的20%。長期以來，GP被用于生產飼料、肥料或者做填埋處理，利用率很低，給生態環境也造成了一定破壞[1]。研究發現，葡萄皮渣中酚類物質(poly-phenolic compounds，PP)含量可達285～550mg/kg，總膳食纖維(total dietary fiber，TDF)含量可達干物質的70%以上[12]，因此，Saura-Calixo等[3]認為葡萄皮渣是一種極具開發價值的抗氧化膳食纖維(antioxidant dietary fiber，ADF)資源。

膳食纖維(dietary fiber，DF)通常是指能抗人體小腸的消化吸收而能在大腸被部分或全部發酵的可食用植物性成分(纖維素、半纖維素、木質素等)、碳水化合物及其類似物質的總稱[4]。目前生產DF的原料通常來源于食品加工過程中的下腳料和廢棄物，它們含有大量的水分、灰分、脂肪、淀粉和蛋白質等雜質，且對溶性膳食纖維(soluble dietary fiber，SDF)含量較低，因此在制備DF時首先需通過一定手段去除雜質提高DF的純度，其次要增加膳食纖維中對人體健康發揮重要作用的SDF的含量改善其生理活性[5]。微生物發酵法是利用微生物液體發酵產酶，酶具有一定生物降解和轉化作用的原理，使原料中的蛋白質、淀粉和脂肪等雜質分解，并使大分子分解成可溶性小分子，提高水溶性膳食纖維的含量。目前的研究多以食品發酵生產的傳統菌種進行，其中以酸奶生產菌種保加利亞乳酸桿菌和嗜熱鏈球菌最為普遍，它們不僅對膳食纖維基料中的淀粉、蛋白質等雜質具有較強的分解能力，而且安全性較高，因此發酵法是一種相對安全、高效、低成本的高品質膳食纖維制備和改良方法[6]。本實驗采用上述兩種菌種對葡萄皮渣進行混菌發酵，以期獲得具有較高純度和品質的膳食纖維產品，為釀酒葡萄皮渣的綜合利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料、菌種與試劑

釀酒葡萄皮渣：葡萄品種為赤霞珠，由新疆中基西域葡萄酒公司提供。

葡萄皮渣經水洗除雜后烘干，粉碎過60目篩并收集篩下物。以無水乙醚浸泡上述粉體除去脂肪，最后用80%乙醇溶液洗滌殘醚后烘干即為葡萄皮渣原料，密封貯存于陰涼干燥處備用。

保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus)和嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)以1:1混合的菌種，購自哈爾濱美華生物技術股份有限公司。

脫脂乳粉 內蒙古蒙牛實業集團股份有限公司；白砂糖為食用級；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

DHP-9082型電熱恒溫培養箱 上海齊欣科學儀器有限公司；TGL-16G型離心機 上海安亭科學儀器廠；JA2003型電子天平 上海精天電子儀器有限公司；HH-6型數顯恒溫水浴鍋 金壇市富華儀器有限公司；SYQDSX-280A型手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠；SW-CJ-1F型超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發酵劑的制備[7-8]

由于牛乳和脫脂牛乳是保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的最佳培養基，因此當菌種要以葡萄皮渣為培養基前，需將葡萄皮渣原料逐步加入脫脂乳以馴化菌種使其適應葡萄皮渣培養基，具體方法如下：

菌種→100mL 10g/100mL的脫脂乳中37℃活化2次→50mL10g/100mL的脫脂乳＋50mL葡萄皮渣汁(蒸餾水:葡萄皮渣原料＝50:1，V/m)混合液37℃培養至凝乳2次→10mL10g/100mL的脫脂乳＋90mL葡萄皮渣汁(水:葡萄皮渣＝50:1，V/m)37℃培養至凝乳→發酵劑(以上菌種馴化過程需控制滅菌條件為105℃, 15min，并于超凈工作臺中接種)。

1.3.2 發酵法制備DF

1.3.2.1 DF的制備方法

準確稱取10.00g葡萄皮渣于錐形瓶中，按一定料液比加入蒸餾水，然后加入皮渣質量2%的脫脂乳粉和1%的白砂糖，混合均勻后滅菌。冷卻至室溫后接入一定量的發酵劑，一定溫度條件下發酵一定時間，發酵結束后抽濾，濾渣洗至中性后干燥即為水不溶性膳食纖維(insoluble dietary fiber，IDF)，向濾液中加入4倍體積95%的乙醇沉析后收集濾渣干燥即為SDF，合并上述濾渣即為TDF。以SDF的產率為衡量指標優化DF的制備工藝條件。

1.3.2.2 DF發酵工藝條件的單因素試驗

準確稱取葡萄皮渣原料10.00g于250mL錐形瓶中，分別以發酵過程中的溫度、時間、接種量和料液比4個因素作單因素試驗，考察各因素對水溶性膳食纖維SDF產率的影響(質量為干物質質量)。

設定pH值為7.0、發酵時間為24h、接種量為1%、料液比1:10，分別選取36、40、44、48℃為不同的發酵溫度進行實驗，發酵結束后計算SDF的產率。

設定pH值為7.0、發酵溫度40℃、接種量為1%，料液比1:10，分別選取16、20、24、28h為不同的發酵時間進行實驗，發酵結束后計算SDF的產率。

設定pH值為7.0、發酵溫度40℃、發酵時間20h、料液比1:10，分別選取0.5%、0.75%、1%、1.25%為不同的接種量進行實驗，發酵結束后計算SDF的產率。

設定pH值為7.0、發酵溫度40℃、發酵時間20h、接種量1%，分別選取1:6、1:8、1:10、1:12為不同的料液比進行實驗，發酵結束后計算SDF的產率。

1.3.2.3 均勻試驗設計法優化工藝條件

通常發酵法制取DF時主要受發酵溫度、時間、接種量和料液比4個因素的交叉影響，根據單因素試驗結果，利用DPS-9.50軟件，選擇四因素五水平的均勻試驗設計，以SDF產率為考察指標，研究4個因素對SDF產率的影響。選用因素和水平見表1。

表1 均勻試驗設計的因素和水平設計表Table 1 Factors and levels used in uniform design

1.3.3 DF主要成分的測定

灰分的測定：采用高溫灼燒法[9]；粗蛋白的測定：采用凱氏定氮法[10]；粗脂肪的測定：采用索氏抽提法[11]；膳食纖維：采用AOAC991.43的方法分別對SDF和TDF進行測定。

1.3.4 DF理化特性的測定

1.3.4.1 膨脹力的測定[12]

準確稱取膳食纖維干樣0.500g，均勻置于25mL刻度試管中后讀取干品體積V0，加入20mL蒸餾水，振蕩搖勻，于室溫條件下放置24h，觀察其自由膨脹體積V1。

1.3.4.2 持水力的測定[13]

準確稱取膳食纖維干樣0.100g，移入50mL離心管中后稱質量m0，加入蒸餾水10mL，振蕩搖勻，室溫放置1h后5000r/min離心20min，小心棄去上清液后稱質量m1。

1.3.4.3 持油性的測定

方法同持水力的測定。選用市售植物油測定DF吸附不飽和脂肪酸的能力。

1.3.4.4 陽離子交換力的測定[14]

稱取0.500g膳食纖維干樣，加0.1mol/L的HCl 20mL，搖勻，室溫放置24h。濾紙過濾，用蒸餾水反復清洗除去多余的酸，轉移殘渣到三角瓶中，加入100mL 15g/100mL的NaCl溶液，磁力攪拌30min，以0.5%的酚酞乙醇為指示劑，0.1mol/L的氫氧化鈉溶液滴定。用蒸餾水代替HC l，記錄空白消耗的氫氧化鈉的量。

式中：V1為樣品消耗的NaOH體積/mL；V0為空白消耗的NaOH體積/mL；m為樣品干質量/g；0.1為NaOH濃度/(mol/L)。

1.3.5 數據處理

數據采用Excel 2007統計分析，重復3次，結果用平均值±標準差表示，并用SPSS軟件進行統計處理，采用ANOVA進行Turkey多重比較分析(P＜0.05)。

2 結果與分析

2.1 發酵溫度對SDF產率的影響

圖1 不同發酵溫度對SDF產率的影響Fig.1 Effect of fermentation temperature on SDF yield

由圖1可知，發酵溫度對葡萄皮渣DF中SDF得率的影響較為顯著，在整個發酵過程中SDF產率表現為先增加后減小的趨勢，40℃時產率達最高值(15.15±0.78)%。由于溫度是影響微生物生長的重要因素之一，微生物體內的眾多生化反應均需要在一定溫度下才能正常進行，而保加利亞乳桿菌的最適發酵溫度為37℃，嗜熱鏈球菌的適宜培養溫度為42℃[15-16]，因此選擇40℃為最適發酵溫度。

2.2 發酵時間對SDF產率的影響

圖2 不同發酵時間對SDF產率的影響Fig.2 Effect of fermentation time on SDF yield

由圖2可知，隨發酵時間的延長，SDF產率逐漸提高，當發酵20h后，SDF得率趨于穩定，可能是由于發酵24h后原料中營養物質耗盡，無法繼續供給微生物存活擴增所需的營養物質，另外發酵時間過長還會導致次級代謝產物積累并產生有害物質，它們均會對菌體的生長產生不利，造成SDF產率下降。綜合以上因素選取20h的發酵時間較為合理。

2.3 接種量對SDF產率的影響

圖3 不同接種量對SDF產率的影響Fig.3 Effect of inoculum size on SDF yield

由圖3可知，當接種量在0.5%～1%的范圍內時隨接種量增加，SDF產率也隨之增加，當接種量超過1%時，SDF產率略有降低。可能是由于接種量過少時，發酵劑不能提供足夠的活菌使葡萄皮渣完全發酵，導致SDF轉化量較少；而接種量過大時由于菌體數量多，消化分解可能會迅速完成，在發酵后期造成菌株營養不足，培養液黏度增加溶氧不足，或可溶性糖類被分解利用，從而導致SDF的產率又有所降低[17]，因此接種量應選1%較為合理。

2.4 料液比對SDF產率的影響

圖4 不同料液比對SDF產率的影響Fig.4 Effect of solid/liquid ratio on SDF yield

由圖4可知，當料液比為1:10時SDF產率可達到峰值(15.10±0.45)%，過高或過低的料液比均會影響SDF的得率。其中料液比為1:6和1:8時，SDF產率明顯偏低，可能是由于葡萄皮渣富含果膠類物質，經滅菌后培養基較為黏稠并出現結塊現象，若加水量較少會導致發酵過程中氧氣傳遞受阻、散熱條件惡化，從而影響微生物的發酵使SDF產率較低；當料液比為1:12時，含量也較低，且料液比過高導致后期醇析時乙醇消耗量較大[18]。從經濟角度考慮，可選擇1:10為最佳料液比。

2.5 發酵工藝條件的優化

為增加試驗點，選用均勻設計表U10，根據其使用表依次安排5個試驗水平(1)～(5)。因均勻設計表U10為10水平表，而本試驗中的4個因素均為五水平，因此采用擬水平法將表中各列的1、2水平取為對應于該列因素的因素水平表中的(1)水平，即：(1)→1、2，(2)→3、4,…,(5)→9、10，均勻設計法制備葡萄皮渣膳食纖維的試驗結果見表2。

試驗結果經DPS軟件處理，用二次逐步回歸分析方法[19]，確定多元二次回歸方程，并對該模型進行顯著性檢驗，回歸方程的顯著性檢驗及方差分析結果見表3。回歸方程為：

由二次回歸方程預測葡萄皮渣SDF產率的最大值及此時各因素的值，得到Xl＝40.4℃、X2＝20.9h、X3＝1.1%、X4＝1:9.5為最佳工藝參數。

表2 均勻設計法制備膳食纖維的試驗結果Table 2 Uniform design arrangement and corresponding results

表3 回歸方程的顯著性檢驗及方差分析Table 3 Significance test and variance analysis of the fitted regression model

由軟件分析可知，相關系數R＝0.99978，顯著水平P＝0.0457＜0.05，剩余標準差s＝0.00079，Durbin-Watson統計d＝2.07511737，接近2，說明該方程能很好地擬合發酵法制備葡萄皮渣膳食纖維的過程，具有顯著性。回歸系數及變量分析結果見表4。

表4 回歸系數及變量分析Table 4 Regression coefficients and their significance in the fitted regression model

從表4各變量偏回歸分析的顯著性檢驗P值大小可知，對葡萄皮渣SDF產率影響的大小為：X1＞X12＞X4＞X2X3＞X2＞X3X4＞X1X3＞X1X4。從回歸的結果可知，因素之間存在交互作用，所以如果用單因素法很難得到一個較優方案。為驗證模型方程的適用性，同時考慮到操作方便性，將上述條件調整為發酵溫度40℃、時間21h、接種量1%、料液比1:10。平行進行5組實驗，SDF的產率為(17.25±0.23)%，接近預測值。說明實驗結果與模型擬合良好，建立的回歸模型能真實的反映各因素對SDF產率的影響，通過此模型優化能夠有效的提高SDF的產率。最終得到的SDF為白色蓬松狀，IDF色澤為暗黃色，無異味，合并后即為葡萄皮渣DF，其樣品顆粒大小均勻，無不良異味。

2.6 葡萄皮渣發酵前后基本成分及理化性質的比較

表5 葡萄皮渣膳食纖維的主要成分及部分功能特性Table 5 Main components physico-chemical properties of native and fermented grape pomaces

由表5可知，葡萄皮渣原料的主要成分為DF，其中TDF含量達69.61%，SDF含量約8.37%，其他成分含量均較低，可見葡萄皮渣是一種良好的膳食纖維資源，具有一定的開發價值。發酵后的產物中TDF提高至84.40%，SDF含量達17.25%，相比葡萄皮渣原料TDF含量和SDF含量分別提高了14.79%和8.88%，而其他雜質成分含量均有顯著降低。說明微生物的消化分解作用，消耗掉了大部分營養物質，使得膳食纖維的純度顯著提高。葡萄皮渣經發酵后其DF的理化性質也得到了一定的改善，其中膨脹力、持水力及持油力3項指標分別達到了3.38mL/g、4.32g/g和1.87g/g，相比原料各項指標均有顯著提高，原因可能是因為發酵后葡萄皮渣中DF的相對含量提高所致，但陽離子交換能力無顯著變化。

3 結 論

3.1 葡萄皮渣是一種質優價廉的膳食纖維資源，利用混合菌種發酵法制備的TDF整體色澤較均勻呈微黃色，無異味，顆粒大小均勻，因此，釀酒葡萄皮渣是一種很有開發前景的農產品加工廢棄物。

3.2 通過試驗優化所得發酵法制取葡萄皮渣膳食纖維的最佳工藝條件為：發酵溫度40℃、時間21h、接種量1%、料液比1:10，在此條件下SDF的產率可達(17.25±0.23)%，且膨脹力、持水力、持油力等理化性質較原料有顯著提高。

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Optimization of Microbial Fermentation of Grape Pomace for Dietary Fiber Preparation

LING Bo1，TIAN Yun-bo1，WU Hong-bin2，MING Jian1,3,*
(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China；2. Instiute of Agro-food Science and Technology,Xinjiang Academy of Agricultural and Reclamation, Shihezi 832000, China；3. Chongqing Special Food Programme and Technology Research Center, Chongqing 400715, China)

Wine grape pomace was fermented with bothLactobacillus bulgaricusandStreptococcus thermophilusto prepare soluble dietary fiber (SDF). Four fermentation conditions affecting SDF yield including temperature, time, inoculum size and material-to-liquid ratio were optimized by one-factor-at-a-time and uniform design methods. The optimal fermentation conditions were determined as 40 ℃, 21 h, 1% and 1:10. Under these conditions, the SDF yield was (17.25 ± 0.23)%. The swelling capacity, water holding capacity and oil holding capacity of the prepared SDF were 3.38 mL/g, 4.32 g/g and 1.87 g/g respectively.Compared with the raw material, the purity and physico-chemical properties of the SDF were improved. In conclusion,microbial fermentation is a good method to prepare high-quality SDF.

grape pomace；dietary fiber；fermentation

R972.6

A

1002-6630(2012)15-0178-05

2011-09-05

國家“863”計劃項目(2011AA100805-2)；新疆生產建設兵團工業科技攻關項目(2009GG39)；新疆生產建設兵團博士資金項目(2009JC12)

令博(1986 —)，男，碩士研究生，研究方向為食品化學與營養學。E-mail：6lb6lb@163.com

*通信作者：明建(1972 —)，男，副教授，博士，研究方向為食品化學與營養學。E-mail：mingjian1972@163.com