豐年蟲水溶性蛋白的分離純化及體外抗氧化性研究

聶 路，張建新*，李文學，劉 胐

(西北農林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100)

豐年蟲水溶性蛋白的分離純化及體外抗氧化性研究

聶 路，張建新*，李文學，劉 胐

(西北農林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100)

目的：對豐年蟲水溶性蛋白進行分離純化，獲得體外抗氧化活性最好的水溶性蛋白組分，并測定其分子質量。方法：豐年蟲水溶性粗蛋白經硫酸銨沉淀、透析、DEAE-Sepharose FF離子交換層析和Sephadex G-100凝膠層析分離純化，對純化后的蛋白質進行體外抗氧化活性的研究，利用SDS-PAGE電泳測定蛋白質分子質量。結果：豐年蟲水溶性蛋白經DEAE-Sepharose FF離子交換層析，梯度洗脫得到4個洗脫峰(峰1～4)，峰2的體外抗氧化活性最強。峰2經Sephadex G-100凝膠層析分離純化得到3個洗脫峰(峰2-1～2-3)，峰2-1的體外抗氧化活性最強。利用SDS-PAGE對峰2-1進行鑒定，得到單一蛋白條帶，純度較高，蛋白分子質量為82.47kD。體外抗氧化活性比較，峰2-1遠遠強于水溶性粗蛋白。結論：蛋白組分峰2-1體外抗氧化活性最強，為單一蛋白組分，其分子質量為82.47kD。

豐年蟲；水溶性蛋白；分離純化；抗氧化活性

豐年蟲(Eubranchipus vernalis)，又名豐年蝦、咸水豐年蝦，是無甲目(Anostraca)甲殼動物。研究表明，豐年蟲富含蛋白質等營養物質，根據Saito法，對其蛋白質進行分類提取，發現水溶性蛋白的體外抗氧化活性最強[1]。本研究通過硫酸銨沉淀、透析、D E A ESepharose FF離子交換層析和Sephadex G-100凝膠層析分離純化豐年蟲水溶性蛋白，測定其羥自由基(·OH)，超氧陰離子自由基(O2－·)和DPPH自由基清除率，研究豐年蟲水溶性蛋白的體外抗氧化活性，利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)對所純化的蛋白進行鑒定，為對豐年蟲蛋白質全方位多用途開發提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豐年蟲，由陜西豐源生物科技有限公司提供。

DEAE-Sepharose FF纖維素、Sephadex G-100 西安沃爾森有限責任公司；石油醚、三羥甲基氨基甲烷(tris)、濃鹽酸、硫酸亞鐵、雙氧水、水楊酸、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、鄰苯三酚、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、硫酸銨、聚乙二醇6000、考馬斯亮藍R250等均為分析純；SDS、丙烯酰胺、N,N-甲叉雙丙烯酰胺、四甲基乙二胺均為電泳級。

1.2 儀器與設備

FA2004分析天平 北京賽多利斯儀器系統有限公司；DF-101S恒溫磁力攪拌器 鄭州長城科工貿有限公司；KDC-40低速離心機 科大創新股份有限公司中佳分公司；ZDJ-4A型自動電位滴定儀 上海精密科學儀器有限公司；UV-2550紫外分光光度計 日本島津公司；PM180R高速冷凍離心機、SIM-FD5505P真空冷凍干燥機 德國西門子公司；自KDY-9830動凱氏定氮儀Ketuo公司；層析柱(玻璃柱1.60cm×100cm、1.60cm×50cm) 自制；SBS-100數控記滴自動部份收集器、HL-2B數顯恒流泵 上海滬西分析儀器廠有限公司；電泳槽(8.2cm×8.5cm) 北京市六一儀器廠；EPS-300型電泳儀上海民儀電子有限公司。

1.3 方法

1.3.1 豐年蟲脫脂粉的制備

豐年蟲經60℃烘干至恒質量，研缽冰浴2h，研磨過80目篩，用石油醚對豐年蟲進行索氏提取脫脂，脫脂粉在室溫下風干12h，置于4℃冰箱保存備用。

1.3.2 豐年蟲水溶性蛋白質的提取

根據Saito法[2]，提取豐年蟲水溶性蛋白，取5g豐年蟲脫脂粉，加入10倍體積的0.02mol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.4)，40℃攪拌提取120min，3500r/min離心20min，收集上清液。測定上清液中水溶性蛋白含量。蛋白質含量測定采用凱氏定氮法，參照GB 5009.5－2010《食品中蛋白質的測定》[3]。

在上清液中加入硫酸銨固體至飽和度為70%(0℃硫酸銨70%飽和度質量濃度為472g/L)，0℃放置30min，10000r/min離心10min，沉淀溶于0.02mol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.4)，在4℃條件下透析48h，冷凍干燥，所得即為水溶性蛋白[4]。

1.3.3 豐年蟲水溶性蛋白的分離與純化過程

豐年蟲水溶性蛋白提取液→硫酸銨分級沉淀(70%飽和度)→透析→DEAE-Sepharose FF離子交換層析→體外抗氧化活性測定→Sephadex G-100凝膠層析→體外抗氧化活性測定→SDS-PAGE電泳

1.3.4 DEAE-Sepharose FF離子交換層析

取20mg豐年蟲水溶性蛋白粗品，溶于2mL 0.02mol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.4)，3000r/min離心10min，取上清液加入DEAE-Sepharose FF離子交換柱(1.6cm×50cm)，先用0.02mol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.4)洗脫未被吸附的蛋白質，再用含0.1～0.5mol/L NaCl的0.02mol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.4)連續洗脫被吸附的蛋白質，洗脫速率1mL/min，每5mL收集一管，每種濃度洗脫100mL，280nm波長處逐管檢測，收集洗脫峰，用聚乙二醇6000反透濃縮洗脫峰，冷凍干燥[5]。

1.3.5 Sephadex G-100凝膠層析

取20mg經DEAE-Sepharose FF離子交換層析后冷凍干燥樣品，溶于2mL 0.02mol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.4)，3000r/min離心10min，取上清液加入Sephadex G-100凝膠柱(1.6cm×100cm)，用0.02mol/L Tris-HCl緩沖液洗脫，洗脫速率0.4mL/min，每4mL收集一管，洗脫液體積為柱體積3倍。280nm波長處逐管檢測，收集洗脫峰，用聚乙二醇6000反透濃縮洗脫峰，冷凍干燥[6]。

1.3.6 SDS-PAGE電泳分析

SDS-PAGE電泳采用不連續體系進行。在蛋白質樣品中加入質量分數為2%的SDS和β-巰基乙醇后，100℃水浴3min。分離膠12%，濃縮膠4%[7]，電極緩沖液用Tris-甘氨酸電極緩沖液。用水-異丙酮-冰醋酸(體積比13:5:2)的0.1%考馬斯亮藍R250染色，水-乙醇-冰醋酸(體積比1 7:1:2)脫色。恒流電泳，濃縮膠電泳電流10mA，分離膠電泳電流20mA。濃縮膠電泳時間1h，分離膠電泳時間3h。采用低分子質量標準蛋白質作為對照[8]，計算純化后蛋白質分子質量，溴酚藍為指示劑[9]。1.3.7 體外抗氧化活性測定

體外抗氧化研究主要選定·OH、O2－·和DPPH自由基。·OH清除率：參照水楊酸法[10]；O2－·清除率：參照鄰苯三酚自氧化法[11]；DPPH自由基清除率：參照Boonmee[12]、Brand-Williams[13]等的方法。

2 結果與分析

2.1 豐年蟲水溶性蛋白質提取率

由表1可知，豐年蟲脫脂粉中總蛋白和水溶性蛋白含量分別占脫脂粉的60.18%和33.64%，水溶性蛋白占總蛋白的55.90%。

表1 豐年蟲脫脂粉中水溶性蛋白質相對百分含量Table 1 Relative content of water-soluble protein in Eubranchipus vernalis

2.2 DEAE-Sepharose FF離子交換層析

圖1 豐年蟲水溶性蛋白DEAE-Sepharose FF柱洗脫圖譜Fig.1 Purification profile of water-soluble protein from Eubranchipus vernalis on DEAE-sepharose fast flow anion-exchange column

由圖1可知，豐年蟲水溶性粗蛋白經D E A ESepharose FF離子交換層析，用0.02mol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.4)和0.1～0.3mol/L NaCl的0.02mol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.4)洗脫，分別得到一個洗脫峰(峰1～4)，0.4mol/L NaCl-0.02mol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.4)和0.5mol/L NaCl-0.02mol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.4)沒有得到洗脫峰[14]。峰1直接被0.02mol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.4)洗脫下來，說明該部分蛋白質不能為離子交換劑所吸附。隨著洗脫液離子強度的增大，與離子交換柱結合緊密的蛋白質也被洗脫下來，分別為峰2、峰3、峰4。分別收集這4個洗脫峰，用聚乙二醇6000濃縮，冷凍干燥備用。

2.3 DEAE-Sepharose FF離子交換層析的洗脫峰體外抗氧化活性測定

表2 DEAE-Sepharose FF離子交換層析各峰組分體外抗氧化活性結果(±s, n=3)Table 2 Antioxidant activity of each fraction obtained by DEAE-sepharose fast flow anion-exchange chromatography(± s, n=3)

表2 DEAE-Sepharose FF離子交換層析各峰組分體外抗氧化活性結果(±s, n=3)Table 2 Antioxidant activity of each fraction obtained by DEAE-sepharose fast flow anion-exchange chromatography(± s, n=3)

注：同列小寫字母不同，表示差異顯著(P＜0.05)；同列大寫字母不同，表示差異極顯著(P＜0.01)。下同。

蛋白組分 ·OH清除率/%O2－·清除率/%DPPH自由基清除率/%峰1 11.15±0.35aA 40.48±0.68aA 40.93±0.74aA峰2 14.56±0.47bA 55.57±0.38bB 65.63±0.90bB峰3 7.63±0.33cB 38.39±0.33bB 29.49±0.35cC峰4 4.89±0.88dB 31.31±1.56cC 28.80±0.65cC

DEAE-Sepharose FF離子交換層析獲得的4個洗脫峰的凍干品，配制成0.05mg/mL蛋白質溶液，測定其體外抗氧化活性。由表2可知，·OH、O2－·和DPPH自由基清除率的測定結果大小排序均為：峰2＞峰1＞峰3＞峰4，峰2對·OH、O2－·和DPPH自由基的清除率分別為14.56%、55.57%和65.53%。因此實驗將大量收集峰2進行下一步純化。

2.4 Sephadex G-100凝膠層析

葡聚糖凝膠分離蛋白質根據分子篩原理，蛋白質按分子質量大小從大到小洗脫下來。Sephadex G-100凝膠層析見圖2。

圖2 Sephadex G-100分離純化峰2的洗脫圖譜Fig.2 Purification profile of Peak-2 on Sephadex G-100 gel permeation column

由圖2可知，Sephadex G-100凝膠層析分離純化峰2，出現3個蛋白峰(峰2-1、峰2-2和峰2-3)，分別收集這3個洗脫峰，用聚乙二醇6000濃縮，冷凍干燥備用。2.5 Sephadex G-100凝膠層析洗脫峰體外抗氧化活性測定

Sephadex G-100凝膠層析獲得的3個洗脫峰凍干品，配制成0.05mg/mL蛋白質溶液，測定其體外抗氧化活性。由表3可知，·OH清除率大小排序為：峰2-1＞峰2-3＞峰2-2，而O2－·和DPPH自由基清除率的結果大小排序大致為：峰2-1＞峰2-2＞峰2-3，峰2-1對·OH、O2－·和DPPH自由基的清除率分別為23.22%、58.35%和71.37%。因此對峰2-1采用SDS-PAGE電泳鑒定其分子質量。

表3 Sephadex G-100凝膠層析各峰組分體外抗氧化活性測定Table 3 Antioxidant activity of each sub-fraction obtained by Sephadex G-100 gel permeation chromatography

2.6 SDS-PAGE電泳結果

圖3 峰2-1組分SDS-PAGE電泳圖譜Fig.3 SDS-PAGE of Peak 2-1

由圖3可知，經DEAE-Sepharose FF離子交換層析和Sephadex G-100凝膠層析后的蛋白質樣品純度較高，是單一條帶。通過標準蛋白對照，可以得到該蛋白條帶的分子質量為82.47kD。

2.7 豐年蟲水溶性粗蛋白與峰2-1體外抗氧化活性比較

2.7.1 ·OH清除率比較

圖4 ·OH清除率測定結果Fig.4 Scavenging activity of Peak 2-1 and crude protein against hydroxyl free radicals

由圖4可知，豐年蟲水溶性粗蛋白和峰2-1對·OH都有抑制作用，且隨著蛋白質質量濃度的增加而增強。比較水溶性粗蛋白和峰2-1，發現在不同蛋白質質量濃度下，峰2-1的·OH清除率都要高于水溶性粗蛋白。抗氧化機理可能是蛋白質提供的氫和·OH結合，形成穩定的自由基并阻止了自由基鏈式反應。另外一種可能就是蛋白質能夠和自由基鏈式反應中必需的離子結合，從而阻止反應進行[15]。

圖5 ·清除率測定結果Fig. 5 Scavenging activity of Peak 2-1 and crude protein against superoxide anion free radicals

2.7.3 DPPH自由基清除率比較

圖6 DPPH自由基清除率測定結果Fig.6 Scavenging activity of Peak 2-1 and crude protein against DPPH free radicals

由圖6可知，豐年蟲水溶性粗蛋白和峰2-1對DPPH自由基清除率隨蛋白質質量濃度的增大而增強。比較它們的DPPH自由基清除率，發現峰2-1要遠遠大于水溶性粗蛋白。

3 結 論

研究結果表明，豐年蟲水溶性粗蛋白經DEAESepharose FF離子交換層析分離純化得到4個洗脫峰(峰1～4)，體外抗氧化實驗表明，峰2的體外抗氧化活性最好。峰2經Sephadex G-100凝膠層析分離純化得到3個洗脫峰(峰2-1、峰2-2、峰2-3)，體外抗氧化實驗表明，峰2-1的體外抗氧化活性最好。用SDS-PAGE電泳鑒定峰2-1，發現是單一蛋白組分，分子質量為82.47kD。對豐年蟲水溶性粗蛋白和峰2-1進行體外抗氧化實驗，比較它們的抗氧化活性，發現·OH、O2－·和DPPH自由基清除率，峰2-1都遠遠強于水溶性粗蛋白。

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Antioxidant Activity of Water-Soluble Protein Purified fromEubranchipus vernalis

NIE Lu，ZHANG Jian-xin*，LI Wen-xue，LIU Fei
(College of Food Science and Engineering, Northwest A&F University, Yangling 712100, China)

Objective: To isolate and purify water-soluble protein with the highest antioxidant activity fromEubranchipus vernalisand determine its molecular weight. Methods: Crude water-soluble protein fromEubranchipus vernaliswas extracted and purified by ammonium sulfate precipitation, salting out, ion-exchange column chromatography, DEAE-fast-flow Sepharose anion-exchange chromatography and Sephadex G-100 column chromatography. The antioxidant activities of different protein fractions were compared and their molecular weights were determined by SDS-PAGE. Results: The prepared crude watersoluble protein was mainly composed of 4 fractions named as Peak-1, Peak-2, Peak-3 and Peak-4 in DEAE-Sepharose fast-flow column chromatography and Peak-2 revealed higher antioxidant activity than other 3 fractions. In addition, Peak-2 was mainly composed of 3 sub-fractions including Peak 2-1, Peak 2-2 and Peak 2-3 in Sephadex G-100 gel-permeation column chromatography.Peak 2-1 exhibited higher antioxidant activity than other 2 sub-fractions. Peak 2-1 was identified by SDS-PAGE to reveal a molecular weight of 82.47 kD. The antioxidant activity of Peak 2-1 was much higher than that of the crude protein extract.Conclusion: Peak 2-1 has obtained fromEubranchipus vernalisas the most antioxidant protein with a molecular weight of 82.47 kD.

Eubranchipus vernalis；water-soluble protein；purification；antioxidant activity

TS254.4

A

1002-6630(2012)15-0122-05

2011-07-08

國家大學生創新性實驗計劃項目(2009A18)

聶路(1986—)，男，碩士研究生，主要從事食品營養與安全研究。E-mail：liuxingynly@163.com

*通信作者：張建新(1959—)，男，教授，碩士，主要從事食品營養與安全研究。E-mail：zhangjx59@foxmail.com