菟絲子黃酮成分分析及對食用油脂的抗氧化活性

陳林林，吳 春

(黑龍江省普通高等學校食品科學與工程重點實驗室，哈爾濱商業大學食品工程學院，黑龍江 哈爾濱 150076)

菟絲子黃酮成分分析及對食用油脂的抗氧化活性

陳林林，吳 春

(黑龍江省普通高等學校食品科學與工程重點實驗室，哈爾濱商業大學食品工程學院，黑龍江 哈爾濱 150076)

采用紫外光譜和高效液相色譜法，對菟絲子中主要黃酮成分，即蘆丁、槲皮素、山奈酚進行定性、定量分析。以蘆丁為標準品，紫外光譜測定菟絲子黃酮提取物，與蘆丁標準品乙醇溶液相同，在300～380nm和240～280nm有兩個吸收峰，可以確定提取物屬于黃酮類化合物；采用高效液相色譜法準確的測定出3種黃酮成分的含量，且重現性好，說明該方法是可靠的。以過氧化值(POV)為指標，以豬油和花生油為介質研究菟絲子黃酮的抗氧化性能。結果表明：菟絲子黃酮對食用油脂有較強的抗氧化作用，且抗氧化效果與添加量有關；在豬油和花生油中，當菟絲子黃酮添加量分別達到0.08%和0.06%時抗氧化效果已高于0.02% BHT和0.01% PG。

菟絲子；黃酮；蘆丁；抗氧化

菟絲子(Semen Cuscutae)為旋花科菟絲子屬植物菟絲子(Cuscuta chinensisLam.)的種子[1-2]，為寄生植物，具有清除氧自由基、擴張血管、改善腦循環、抑制血小板活化因子(PAF)等作用[3-4]。其主要化學成分為黃酮，且為重要的活性成分之一。黃酮類化合物廣泛存在于自然界，是目前倍受關注的天然活性產物之一，泛指兩個苯環(A環與B環)通過中央三碳鏈相互連接而成的一系列C6－C3－C6化合物，主要指以2-苯基色原酮為母核的化合物[5-7]。天然植物黃酮類物質在食品和醫藥工業上具有廣泛的應用。菟絲子中的黃酮類化合物以槲皮素、蘆丁及山奈酚為主[8-9]。本實驗通過紫外光譜法確定提取物中黃酮類化合物的存在，采用高效液相色譜法對蘆丁、槲皮素、山奈酚進行定性、定量的測定，并通過Schaal烘箱法測定菟絲子黃酮對食用油脂的抗氧化性能，以期為菟絲子黃酮在食品及藥品中的有效利用提供一定的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菟絲子購于哈爾濱市寶豐藥店；蘆丁標準品(98%以上)中國醫藥集團上海化學試劑公司；槲皮素標準品(98.5%以上)、山奈酚標準品(98%以上) 上海同田生化試劑公司；大孔吸附樹脂 南開大學化工廠；無水乙醇、氯仿、乙酸乙酯、磷酸均為分析純試劑；甲醇為優級醇。

1.2 儀器與設備

FZ102型植物粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司；PC-1000數顯示恒溫水浴鍋 上海精密儀器儀表有限公司；R-201旋轉蒸發儀 上海申勝生物技術有限公司；UV-190型紫外光譜儀 日本島津公司；高壓液相色譜儀、2487紫外檢測器 美國Waters公司；XDB-C18色譜柱(4.6mm×150mm，5μm) 美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 菟絲子總黃酮的提取純化

將菟絲子粉碎過篩后經石油醚脫脂，準確稱取處理過的菟絲子10g于250mL三角瓶中，在固液比為1:16(m/V)、75℃條件下用體積分數70%乙醇提取2h，取出過濾，將濾渣二次浸提后過濾，合并兩次所得濾液，將其采用H-103型大孔吸附樹脂進行純化，通過減壓濃縮、真空干燥后即得菟絲子黃酮[10-12]。

1.3.2 菟絲子總黃酮含量的測定

標準曲線繪制：準確稱取蘆丁(105℃干燥至恒質量)0.0794g于100mL燒杯中，用體積分數30%乙醇溶解后轉移至250mL容量瓶中，定容至刻度，配成0.3176g/L的標準溶液。標準曲線的繪制根據文獻[13]，得蘆丁質量濃度(y，mg/mL)與吸光度(x)之間的回歸方程為：y＝0.11530.00108，R2＝0.9998。

取1mL 定容后的提取液于25mL容量瓶中，其余步驟與標準曲線的制作方法相同。

1.3.3 菟絲子黃酮紫外光譜檢測

將0.5mg/mL的蘆丁標準溶液和0.5mg/mL純化后的菟絲子黃酮溶液，在波長為190～500nm范圍內進行掃描，通過與蘆丁標準溶液的光譜圖作對比，確定提取液中黃酮類物質的存在[14]。

1.3.4 菟絲子黃酮高效液相色譜檢測

分別將純化后的菟絲子黃酮和柱層析收集的各組分10mg用色譜甲醇溶解，經0.45μm濾膜過濾后，移入50mL容量瓶中，用甲醇定容[15]。同時用甲醇配制含有蘆丁、槲皮素、山奈酚的混合標準溶液，質量濃度分別為0.132、0.140、0.072mg/mL。

分別精密量取2、4、6、8、10μL的混合標準溶液進樣，通過3種標準品的峰面積，確定各自關于質量濃度與峰面積的標準曲線。再分別精密量取待測物進樣，與標準品的保留時間相對照進行待測樣的定性；通過標準溶液的含量，以峰面積外標法計算含量。

液相色譜條件為：C18色譜柱，YGW預柱，流動相為磷酸-甲醇(體積比1:1)，流量1.5mL/min，進樣量10μL，檢測波長360nm。

1.3.5 菟絲子黃酮對食用油脂抗氧化性能的測定

采用Schaal烘箱法：取50g油樣，放入100mL燒杯中，敞口，分別將菟絲子黃酮、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)和沒食子酸丙酯(PG)等按一定比例加入油樣中，攪拌，使其充分溶解，同時設置空白對照組。然后將油樣放入60℃鼓風烘箱中強化保存，每隔24h攪拌一次，并交換它們在烘箱中的位置。根據國家標準GB/T 5009.37－1996《食用植物油衛生標準的分析方法》定期測定油樣的過氧化值(POV)[16-17]。

根據食用油脂衛生標準規定，油脂中POV達到11.8meq/kg時所需時間為誘導時間，即AOM值。通過計算方程lnc＝－kt＋lnc0(c為POV/(meq/kg)；k為速率常數；t為時間/d；c0為油脂起始POV/(meq/kg))得到AOM值。保護系數(PF)要通過誘導時間來計算，見以下公式。

2 結果與分析

2.1 菟絲子黃酮的紫外光譜分析

黃酮類化合物具有羰基與兩芳香環形成較強的共軛體系，其在乙醇中的紫外吸收光譜由兩個主要吸收帶組成：出現在300～380nm，為B環肉桂酰的吸收；出現在240～280nm，為A環的苯甲酰結構。因此可根據這兩個吸收峰初步判斷黃酮類化合物的存在。

選擇蘆丁標準品的紫外光譜與提取液的紫外光譜進行比較，確定菟絲子提取液中黃酮類物質的存在，結果見圖1。

圖1 蘆丁標準品與菟絲子提取液的紫外吸收光譜Fig.1 UV absorption spectra of rutin standard and the extract of Semen Cuscutae

由圖1可知，提取液與蘆丁標準品一樣，在320～380nm和260～280nm有兩個吸收峰，可以確定提取液屬于黃酮類化合物。但是提取液在320～380nm波長處的峰形不顯著，原因是與提取物中存在不同的黃酮類物質導致峰的疊加有關。

2.2 菟絲子黃酮的高效液相色譜分析

圖2 混合標準品HPLC譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of mixed standards

將圖2中各色譜峰面積與標準品質量濃度求回歸方程，以峰面積為縱坐標，以質量濃度橫坐標分別做蘆丁、槲皮素、山奈酚的標準曲線為：y＝11608x＋49772，R2＝0.9996，線性范圍為13～132μg/mL；y＝12571x＋40348，R2＝0.9997，線性范圍為14～140μg/mL；y＝29831x＋35615，R2＝0.9997，線性范圍為7～70μg/mL。

將菟絲子黃酮(圖3)與混合標準品的HPLC譜圖作對照，菟絲子黃酮含有的蘆丁、槲皮素、山奈酚與標準品在相同的保留時間出峰，定性的說明這3種成分的存在。同時可以根據混合標準品通過液相得出的含量與峰面積的標準曲線，確定這3種成分的含量分別為：0.179、0.162、0.158mg/mL。

圖3 菟絲子黃酮HPLC譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of flavonoids from Semen Cuscutae

按樣品測定方法，對樣品進行5次平行實驗，結果得RSD為1.85%，說明本法的重現性良好。

2.3 菟絲子黃酮對食用油脂的抗氧化性能

2.3.1 對豬油的抗氧化作用

將菟絲子黃酮以不同的比例加入至50g豬油中，按照Schaal烘箱法，定期測定POV，結果見表1。空白樣品的POV從第8天開始急劇增大，菟絲子黃酮的添加量小于0.04%時，隨時間的延長，POV增大較快，但仍小于空白樣；當菟絲子黃酮的添加量達到0.08%時POV的變化幅度已經小于0.02% BHT和0.01% PG；菟絲子黃酮添加量為0.10%的實驗組在20d內POV變化最平緩，說明其抗氧化效果是最佳的。添加抗氧化劑的豬油樣品的誘導時間均大于空白樣品的誘導時間。每組添加量菟絲子黃酮的保護系數均大于1，說明該物質對豬油具有抗氧化作用，且隨著添加量的增加，其對豬油的抗氧化作用增強。菟絲子黃酮的添加量達到0.06%時，即具有明顯的抗氧化活性(PF＞2)；當添加量達到0.08%時，其抗氧化能力已大于0.02%BHT或0.01% PG。

表1 菟絲子黃酮與合成抗氧化劑對豬油抗氧化作用的比較Table 1 Antioxidant effects of flavonoids from Semen Cuscutae and synthetic antioxidants on lard

2.3.2 對花生油的抗氧化作用

將菟絲子黃酮以不同的比例加入至50g花生油中，按照Schaal烘箱法，定期測定POV，結果見表2。

表2 菟絲子黃酮與合成抗氧化劑對花生油的抗氧化作用比較Table 2 Antioxidant effects of flavonoids from Semen Cuscutae and synthetic antioxidants on peanut oil

由表2可知，空白樣品的POV從第4天開始明顯增大，菟絲子黃酮的添加量大于0.02%時，隨時間的延長，POV增大趨勢緩慢；當菟絲子黃酮的添加量達到0.06%以上時POV的變化趨勢平緩。添加抗氧化劑的花生油樣品的AOM值均大于空白樣品的AOM值。每組添加量菟絲子黃酮的保護系數均大于1，說明該物質對花生油具有抗氧化作用。且隨著添加量的增加，其對花生油的抗氧化作用增強。菟絲子黃酮的添加量達到0.06%時，即具有明顯的抗氧化活性(PF＞2)，且其抗氧化能力已大于0.02%BHT或0.01%PG。菟絲子黃酮在添加量為0.01%～0.1%范圍內的POV均比在豬油中小，說明其對花生油的抗氧化效果好于豬油。

3 結 論

根據以上的結果與分析可知，采用紫外光譜和高效液相色譜法，對菟絲子中3種黃酮成分，即蘆丁、槲皮素、山奈酚進行的定性、定量測定，得到的分析結果可靠性高。確定了菟絲子中黃酮類化合物的存在及其含有的3種成分的含量。通過考察菟絲子黃酮對食用油脂的抗氧化作用，確定當菟絲子黃酮添加量分別為0.08%和0.06%時，其對豬油和花生油的抗氧化活性好于0.02% BHT或0.01% PG抗氧化劑，說明菟絲子黃酮更具實際應用性。

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Composition Analysis of Flavonoids fromSemen Cuscutaeand Antioxidant Activity in Edible Oil and Fat

CHEN Lin-lin，WU Chun
(Key Laboratory for Food Science and Engineering, College of Food Engineering,Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China)

Flavonoids fromSemen Cuscutaeincluding rutin, quercetin and kaemperferol were determined qualitatively and quantitatively by ultraviolet spectroscopy and high performance liquid chromatography (HPLC). Using rutin as standard substance, flavonoid extract ofSemen Cuscutaewas determined and found to show two absorption peaks in the range of 300—380 nm and 240—280 nm. The contents of three flavonoid components were determined accurately by HPLC with repeatable results. Flavonoids fromSemen Cuscutaedisplayed strong antioxidant activity in lard and peanut oil in a dose-dependent manner as evaluated based on peroxide value. In both matrices, the antioxidant effect at doses of 0.08% and 0.06% was superior to that of 0.02% BHT and 0.01% PG.

Semen Cuscutae；flavonoids；rutin；antioxidant activity

TS218

A

1002-6630(2012)15-0103-04

2011-06-30

黑龍江省自然科學基金項目(B201001) ；黑龍江省高校科技創新團隊建設計劃資助項目(2010td04)

陳林林(1979—)，女，講師，博士，研究方向為食品科學。E-mail：linclear1207@yahoo.com.cn