葛仙米藻膽蛋白的體外消化特性

程 超，李 偉，汪興平,*，潘思軼

(1.湖北民族學院生物科學與技術學院，湖北 恩施 445000；2.華中農業大學食品科學技術學院，湖北 武漢 430070)

葛仙米藻膽蛋白的體外消化特性

程 超1,2，李 偉1，汪興平1,*，潘思軼2

(1.湖北民族學院生物科學與技術學院，湖北 恩施 445000；2.華中農業大學食品科學技術學院，湖北 武漢 430070)

研究葛仙米藻膽蛋白在體外模擬胃液和腸液的消化產物性質，重點測定不同消化時間產物的可溶性蛋白質、游離氨基含量變化及其抗氧化作用，并利用HPLC法測定消化產物分子質量變化情況。結果表明：在胃液和腸液消化作用下蛋白質含量均呈現下降趨勢，而游離氨基含量呈現上升趨勢，消化產物較初始產物對ABTS+·和脂質過氧化具有更強的抑制作用，但對·OH的清除能力卻有所下降；偏相關分析結果表明，與葛仙米藻膽蛋白消化產物的抗氧化作用緊密相關的是消化產物中的分子質量為6ku和0.2ku的肽類。

葛仙米；藻膽蛋白；模擬胃腸液；抗氧化；高效液相色譜

藻膽蛋白酶解可提高其生理功能，如在最適胃蛋白酶和胰蛋白酶酶解條件下，螺旋藻藻膽蛋白酶解產物對ACE的抑制率分別為82.16%和93.54%[1]；用堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶處理也可得到高活性的ACE抑制肽，且體內活性強于體外[2]。螺旋藻粉粗提液經兩種不同酶解方法酶解，都能有效提高螺旋藻干藻粉抗氧化、降血壓活性[3]。藻藍蛋白經胰蛋白酶酶解時，隨酶解時間延長酶解液清除自由基能力逐漸增強[4]。利用堿性蛋白酶酶解螺旋藻蛋白，發現307～1450D范圍的螺旋藻小分子肽為水解物中抗氧化能力最強的成分[5]。胰蛋白酶酶解藻藍蛋白得到的肽抗氧化活性是藻藍蛋白的5倍，且能有效保護質粒DNA免受2,2-偶氮二(甲基丙基咪)二鹽酸鹽(AAPH)攻擊[6]。藻藍蛋白和其胰蛋白酶酶解產物對人宮頸癌HeLa細胞株的體外生長抑制作用有明顯的劑量效應，酶解時間為l、2h的酶解產物的抗腫瘤活性明顯高于藻藍蛋白[7]。藻藍蛋白酶解物的抗腫瘤活性明顯高于相同濃度下的藻藍蛋白，不同酶解條件下的酶解產物對不同腫瘤細胞的抑制作用不同，且差異顯著，這說明酶解產物分子質量及其結構對其抗癌功能的發揮具有重要作用[8]。王雪青等[9]選擇不同的酶解條件制備得到了不同抗癌活性的活性肽。

以上資料表明藻膽蛋白酶解后抗氧化、抗癌活性會增強，同時也會派生出其他的生理功能，但以上研究主要集中在螺旋藻這類藻膽蛋白，對葛仙米藻膽蛋白消化未見報道；同時以上研究主要采用蛋白酶對其進行酶解，而日常生活對此類原料的攝取主要是通過口腔攝入，藻膽蛋白經體內的腸胃消化后的產物作用如何值得探討。因此本實驗建立體外胃、腸液模擬體系，研究葛仙米藻膽蛋白消化產物的成分含量和抗氧化特性，以期初步明確藻膽蛋白在體內發揮作用的成分。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葛仙米藻膽蛋白：準確稱取30g脫脂干葛仙米粉用適量蒸餾水復溶，于－20℃反復凍融3次，用pH7.3磷酸氫二鉀-氫氧化鈉緩沖液在4℃條件下浸提，10000r/min離心15min，20%硫酸銨沉淀去除雜蛋白，繼續用60%硫酸銨沉淀，沉淀透析后冷凍干燥得產品。

胃蛋白酶(3000U/mg)、胰蛋白酶(250U/mg)、D-脫氧核糖 美國Amresco公司；抗壞血酸 科瑞生化試劑公司；考馬斯亮藍試劑盒 南京建成生物工程研究所；賴氨酸 上海政翔化學試劑研究所；2,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS) 上海化學工業發展有限公司；鄰苯二甲醛(OPA)、三氯乙酸、硫酸亞鐵、雙氧水、三氯化鐵、乙二胺四乙酸二鈉、三羥基氨基甲烷、硫酸銨、鹽酸(均為分析純) 國藥集團化學試劑有限公司；硫代巴比妥酸 天津市凱通化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

Avanti J-301高速冷凍離心機 美國Beckman-Coulter公司；ALPHA1-4真空冷凍干燥機 德國Chris公司；UV1900PC紫外雙光束-可見分光光度計 上海亞研電子科技有限公司；高效液相色譜儀(Waters 2998 Photodiode Array Detector；Waters e2995 Separations medule) 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 體外胃液和腸液的模擬[10]

2×人工胃液：1000mL溶液中含有NaCl 4.0g、胃蛋白酶6.4g、14mL濃鹽酸。pH 值約為1.2，胃蛋白酶的活力為3000～3500U/mg。

2×人工腸液：將13.6g KH2PO4溶于250mL 雙蒸水，振蕩，完全溶解后加190mL 0.2mol/L NaOH 和400mL的雙蒸水。加胰蛋白酶20.0g, 混勻，用0.2mol/L NaOH調pH值到7.5±0.1，雙蒸水定容于1000mL。胰蛋白酶的活力為4U/mg。

1.3.2 蛋白質在人工胃液中的消化程度

取11個50mL三角瓶，每瓶加10mL 2×人工胃液，37℃保溫10min。然后在各瓶中分別加入10mL 20mg/mL葛仙米藻膽蛋白溶液，37℃消化，按時間梯度0、1、5、10、15、30、60、90、120、150、180min準確計時，用0.168mol/L Na2CO3調整pH值為7～8終止反應。冷凍干燥得不同模擬胃液消化的樣品。

1.3.3 蛋白質在人工腸液中消化程度

取11個50mL三角瓶，每管加入10mL的2×人工腸液，37℃保溫10min。在各瓶中分別加入10mL 葛仙米藻膽蛋白溶液( 37℃預熱)，37℃消化，按0、1、5、10、15、30、60、90、120、150、180min準確計時，90℃加熱5min終止反應，冷凍干燥得不同模擬腸液消化的樣品。

1.3.4 可溶性蛋白質含量測定

采用Bradford法[11]。

1.3.5 游離氨基含量測定

采用鄰苯二甲醛法[12]。以賴氨酸為標準品，以賴氨酸含量(0～160μg)為橫坐標(x)，以A340nm為縱坐標(y)繪制標準曲線，擬合得其回歸方程為y＝0.0090.0039，r＝0.9994。

樣品中游離氨基含量測定：準確稱取不同胃液和腸液消化時間的冷凍干燥樣品70mg，分別溶于3mL蒸餾水中，將此樣品溶液稀釋4倍后，取100μL 稀釋樣液，加100μL蒸餾水，4mL OPA試劑，混勻后35℃反應2min，以OPA試劑加200μL蒸餾水為空白，于340nm波長處測定吸光度。

式中：m為消化產物的質量/g；K為消化產物溶液的稀釋倍數。

1.3.6 消化產物的抗氧化作用

參照參考文獻[13]的方法測定消化產物對ABTS+·的清除作用、消化產物對H2O2誘導的脂質過氧化的抑制作用，利用D-脫氧核糖體系測定消化產物對·OH的清除作用[14]。

1.3.7 胃液和腸液消化產物的HPLC分析

采用β-葡萄糖苷酶(129.0ku，保留時間9.897min)、牛血清白蛋白(65.91ku，保留時間10.64min)、胰蛋白酶(23.12ku，保留時間12.14min)、VB12(1.339ku，保留時間14.18min)為標準品，以標樣分子質量為橫坐標，保留時間為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程y＝－ 0.9264lnx＋14.60，r＝0.9871。

HPLC柱型號：SEC-300(4.8mm×300mm)Sepax Technologies；洗脫液：0.1mol/L pH7.0 磷酸鹽緩沖液；上樣量：20μL，柱溫：25℃；流速：0.3mL/min；檢測波長：280nm[15]。

2 結果與分析

2.1 葛仙米藻膽蛋白不同消化時間蛋白質和游離氨基含量變化

表1 胃、腸液不同消化時間蛋白質和游離氨基含量的變化Table 1 Changes in protein and free amino acid contents during digestion of Nostoc sphaeroides k.ting phycobiliprotein in simulated gastric or intestinal fluids

表1 胃、腸液不同消化時間蛋白質和游離氨基含量的變化Table 1 Changes in protein and free amino acid contents during digestion of Nostoc sphaeroides k.ting phycobiliprotein in simulated gastric or intestinal fluids

注：同列肩標字母不同表示差異顯著(P＜0.05)。

由表1可知，在胃液和腸液中隨消化時間延長可溶性蛋白含量下降，對其進行顯著分析發現，胃液0、1min消化產物可溶性蛋白含量無差異，但5min開始顯著下降，這說明在模擬胃液消化中蛋白質在5min時開始大量被消化，且在胃液處理90min內蛋白質消化幅度變化不大，120min時又開始明顯消化。腸液消化產物在1min與0min可溶性蛋白質含量顯著下降，這說明腸液初始處理就對蛋白質具有消化作用，同胃液一樣在腸液處理的90min內蛋白質具有小幅下降。游離氨基的含量變化與可溶性蛋白含量相反，呈現增加趨勢。

2.2 葛仙米藻膽蛋白消化產物的抗氧化特性

2.2.1 消化產物對ABTS+·的清除作用

取不同消化時間的樣品70mg，加蒸餾水3mL溶解，測定消化產物對ABTS+·的清除率，結果見圖1。葛仙米藻膽蛋白的胃液和腸液消化產物對ABTS+·的清除能力隨著消化時間的延長而增強，但是120min腸液消化產物的ABTS+·清除能力有所下降，而150min胃液消化產物對ABTS+·的清除作用略有下降。總體上胃液消化產物對ABTS+·的清除作用強于腸液消化產物。

圖1 消化產物對ABTS+·的清除作用Fig.1 Changes in ABTS+· radical scavenging effect during digestion of Nostoc sphaeroides k.ting phycobiliprotein in simulated gastric or intestinal fluids

2.2.2 消化產物對·OH的清除作用

圖2 消化產物對·OH的抑制作用Fig.2 Changes in hydroxyl radical scavenging effect during digestion of Nostoc sphaeroides k.ting phycobiliprotein in simulated gastric or intestinal fluids

由圖2可知，胃液消化產物對·OH清除作用均強于腸液的消化產物，但腸液和胃液初期消化產物對·OH清除作用均有所下降，二者在消化處理10min后對·OH抗氧化作用回升，之后一直保持上升趨勢，但消化處理180min均未超過初始消化產物對·OH的清除作用。

2.2.3 消化產物對H2O2誘導的脂質過氧化的抑制作用

圖3 消化產物對H2O2誘導的脂質過氧化的抑制作用Fig.3 Changes in inhibitory effect on H2O2-induced lipid peroxidation during digestion of Nostoc sphaeroides k.tingphycobiliprotein in simulated gastric or intestinal fluids

由圖3可知，腸液消化產物對脂質過氧化抑制作用強于胃液，且腸液消化產物對脂質過氧化的抑制作用隨時間延長而增強，至消化處理90min達最高值，之后略有小幅下降；胃液消化產物隨消化時間延長對脂質過氧化抑制作用顯著增加，到消化處理60min時達最高值，隨后略有小幅下降，但均顯著高于初始樣品對脂質過氧化的抑制作用。

由表2可知，模擬胃、腸液中，所測定消化產物抗氧化指標與不同消化時間的蛋白質含量均呈負相關，即可溶性蛋白質含量越低抗氧化效果越好；但與游離氨基含量呈正相關，模擬胃液中對·OH抑制率與游離氨基含量的相關性達到了極顯著水平(P＜0.01)。模擬腸液中各個抗氧化指標與游離氨基含量達到了顯著或極顯著水平(P＜0.05，P＜0.01)。

表2 模擬胃腸液消化產物中蛋白質和游離氨基含量與其抗氧化特性的相關性Table 2 Partial correlation analysis between antioxidant properties and protein or free amino content for digestion products in simulated gastric fluid

2.3 葛仙米藻膽蛋白的消化產物HPLC分析

表3 模擬胃、腸液不同消化時間產物保留時間及分子質量Table 3 Retention time and molecular weight of digestion products harvested during digestion of Nostoc sphaeroides k.ting phycobiliprotein in simulated gastric or intestinal fluids

表3 模擬胃、腸液不同消化時間產物保留時間及分子質量Table 3 Retention time and molecular weight of digestion products harvested during digestion of Nostoc sphaeroides k.ting phycobiliprotein in simulated gastric or intestinal fluids

胃液消化 保留時 相對峰 分子質時間/min間/min面積/% 量/ku 1 6.970 9.984 3791 12.91 90.02 6.225 7.137 9.324 3166 5 12.90 90.68 6.293 6.901 7.302 4084 10 12.99 91.35 5.710 16.42 0.2353 0.1408 21.44 1.112 7.135 13.96 3172 12.99 74.99 5.710 15 14.38 2.213 1.274 16.44 2.501 0.1378 17.72 1.586 22.55 0.2441 6.9178 6.418 4011 7.519 2.889 2096 30 12.83 63.01 6.787 14.47 16.10 1.156 16.47 6.215 0.1334 17.73 1.348 6.956 7.746 3849 7.300 4.535 2655 60 12.87 80.51 6.500 16.52 1.726 0.1264 21.52 0.4308 6.889 13.85 4137 90 12.92 72.20 6.158 16.29 5.801 0.1620 21.32 0.9446 6.858 13.77 4278 120 12.93 73.91 6.092 16.27 4.090 0.1656 21.27 1.933 6.773 3.433 4689 150 12.99 83.97 5.710 16.49 7.113 0.1306 21.61 0.7405 6.818 11.29 4467 13.01 72.90 5.588 180 15.87 1.764 0.2550 16.24 4.531 0.1710 21.25 2.214腸液消化 保留時 相對峰 分子質時間/min間/min面積/% 量/ku 6.367 2.107 7269 6.704 5.331 5052 1 9.624 0.1920 216.1 13.23 71.49 4.407 14.34 16.27 1.330 16.41 4.616 0.1423 6.324 2.409 7614 6.766 5.247 4725 5 9.597 0.1563 222 13.18 72.20 4.651 14.28 15.38 1.419 16.36 4.611 0.1502 6.428 5.931 6806 6.871 1023 4219 10 9.685 0.3380 202.3 13.09 79.97 5.126 16.51 3.527 0.1278 6.346 4.150 7435 6.685 8.420 5157 15 9.654 0.2534 209.2 13.03 84.40 5.469 16.46 2.773 0.1349 6.348 2.513 7419 6.720 5.143 4966 30 9.676 0.08592 204.3 13.07 88.54 5.238 16.42 3.719 0.1408 6.360 2.221 7324 60 6.776 6.706 4674 12.94 87.75 6.027 16.36 3.326 0.1502 6.844 9.376 4343 90 12.98 88.68 5.772 16.45 1.944 0.1363 6.395 2.008 7052 120 6.721 7.621 4960 12.99 88.43 5.710 16.48 1.941 0.1320 6.395 2.331 7052 6.790 5.845 4604 150 12.45 34.58 10.23 12.91 50.99 6.225 15.74 3.124 0.2934 6.815 13.37 4481 180 12.86 84.85 6.570 16.38 1.774 0.1470

由表3可知，腸液消化產物的分子質量主要集中在4.407～6.570ku，這部分消化產物大約占75%～90%；胃液消化產物的分子質量主要集中在5.588～6.787ku，這部分消化產物大約占72%～92%。此外在胃液和腸液消化產物中還存在分子質量為100～200u的肽類，大約占總體消化產物的0.5%～7%。

2.4 胃液和腸液消化產物與其抗氧化作用的相關性

表4 胃液、腸液消化產物HPLC不同保留時間與抗氧化指標的相關性Table 4 Correlation analysis between antioxidant properties and retention time for digestion products harvested during digestion of Nostoc sphaeroides k.ting phycobiliprotein in simulated gastric or intestinal fluids

表4 胃液、腸液消化產物HPLC不同保留時間與抗氧化指標的相關性Table 4 Correlation analysis between antioxidant properties and retention time for digestion products harvested during digestion of Nostoc sphaeroides k.ting phycobiliprotein in simulated gastric or intestinal fluids

保留時間/min 皮爾遜相關系數脂質過氧化抑制 ·O H ABTS+·7 0.034 －0.167 －0.072胃液 12.9 0.530 0.753* 0.567 16 0.583 0.772** 0.261 22 －0.591 －0.545 －0.651*6.6 －0.228 0.013 －0.250腸液 9 －0.228 －0.228 －0.056 16 －0.939** －0.686* －0.807**13 0.835** 0.671* 0.924**

由于在胃液和腸液消化產物中具有不同分子質量的肽類，將胃液和腸液消化產物不同保留時間的相對峰面積與上述抗氧化指標進行偏相關分析，以確定這些肽對抗氧化的貢獻率。由表4可知，胃液消化產物中保留時間為12.9min的消化產物(分子質量6ku左右)對·OH清除作用具有顯著相關，對ABTS+·的清除作用也具有相關性；保留時間為16min的消化產物(分子質量0.2ku左右)對·OH清除作用的相關性達到了極顯著水平，對脂質過氧化抑制也具有相關性；保留時間為7、22min的消化產物對抗氧化指標幾乎全部具有負相關(7min消化產物對脂質過氧化抑制為正相關)，這說明胃液消化產物的分子質量對其抗氧化作用具有重要影響，過大與多小均會使其抗氧化作用下降。腸液消化產物中保留時間為13min(分子質量6ku左右)的消化產物與其抗氧化指標達到了顯著正相關，保留時間為6.6、9、16min的消化產物對抗氧化指標具有負相關。

3 討 論

目前人們越來越有興趣開發利用食物來源的生物活性肽作為保健食品，肽鍵斷裂會導致游離氨基和羧基基團含量增加，從而增加其溶解性，水解破壞蛋白三級結構，降低蛋白質分子質量，進而改變蛋白質功能性質，但過度水解會對其功能性質產生負面作用。目前已報道[16]來源于不同蛋白質的水解產物具有抗氧化活性，但蛋白質酶解產物的分子質量對其抗氧化活性影響非常大，且與原料蛋白質有關。

在葛仙米藻膽蛋白胃液和腸液消化產物中，其可溶性蛋白質含量下降，游離氨基含量上升，所測定的幾種抗氧化指標與可溶性蛋白含量呈負相關，而與游離氨基含量呈正相關。模擬腸液消化產物中分子質量約為6ku的消化產物對其抗氧化左右貢獻最大，模擬胃液中除了6ku的消化產物外，分子質量約為0.2ku的消化產物對其抗氧化也具有一定的作用；不同分子質量消化產物對其抗氧化作用的貢獻尚需進行分離純化制備不同產品加以驗證。本實驗是在單獨的模擬胃液和腸液中進行的，而動物體實際消化情況是先胃液后腸液，胃腸液共同作用于葛仙米藻膽蛋白，這部分實驗目前正在深入研究。

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Digestion Characteristicsin vitroof Phycobiliprotein fromNostoc sphaeroidesKu..ting

CHENG Chao1,2，LI Wei1，WANG Xing-ping1,*，PAN Si-yi2
(1. Biological Scientific and Technical College, Hubei University for Nationalities, Enshi 445000, China；2. College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

In this study, some properties of products produced during digestion ofNostoc sphaeroidesk. ting phycobiliprotein in simulated gastric and intestinal fluids were investigated especially such as soluble protein and free amino acid contents and antioxidant properties. Meanwhile, the change in molecular weight during digestion ofNostoc sphaeroidesk.ting phycobiliprotein was determined by HPLC. The results showed that protein content revealed a downward trend during digestion in each stimulated fluids, and consequently free amino acid content exhibited an upward trend. Digestion products had stronger ABTS radical scavenging and anti-lipid peroxidation activities but weaker hydroxyl radical scavenging activity inD-deoxyribose system thanNostoc sphaeroideskting phycobiliprotein. The results of partial correlation analysis demonstrated that 6 ku and 0.2 ku peptides were closely related to the antioxidant effect of digestion products ofNostoc sphaeroidesk. ting phycobiliprotein.

Nostoc sphaeroidesKting；phycobiliprotein；simulated gastric and intestinal fluids；antioxidant activity；HPLC

TS201.1

A

1002-6630(2012)15-0006-05

2012-04-12

國家自然科學基金項目(31260365)；湖北民族學院團隊項目(MY2008T004；MYT2007004)

程超(1976—)，女，副教授，博士研究生，研究方向為食品化學。E-mail：chengchaolw@126.com

*通信作者：汪興平(1963—)，男，教授，博士，研究方向為天然產物化學。E-mail：hbmywxp@163.com