高效液相色譜法分析北方部分地區蜂膠醇提物成分

趙亮亮，王光新，陳 平，董 捷，張紅城,*

(1.哈爾濱商業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150076；2.中國農業科學院蜜蜂研究所，北京 100093)

高效液相色譜法分析北方部分地區蜂膠醇提物成分

趙亮亮1,2，王光新2，陳 平1，董 捷2，張紅城2,*

(1.哈爾濱商業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150076；2.中國農業科學院蜜蜂研究所，北京 100093)

研究北方部分地區的蜂膠提取物中組分含量的差異并對成分分析。采用乙醇水溶液對中國北方11個省市的蜂膠進行提取，以NaNO2-Al(NO3)3比色法和Folin-Ciocalteu試劑比色法分別測定蜂膠不同提取物的總黃酮和總酚酸含量；并且借助標準品以高效液相色譜法對不同提取物中的酚類化合物進行初步定性和定量，進而模擬蜂膠的區域性。結果表明：不同地區的蜂膠含有的總黃酮和總酚酸不同，其中咖啡酸、坎非醇、松屬素、柯因、高良姜素、苯甲酰肉桂酯以河南蜂膠含量最高；芹菜素、異鼠李素以遼寧蜂膠含量最多；山東蜂膠含有最多的鼠李素。關鍵詞：蜂膠提取物；高效液相色譜；成分分析

蜂膠是蜜蜂從植物芽胞或樹干采集的樹膠，混入蜜蜂的上額腺、蜂蠟而形成的芳香性樹脂狀固體物質[1]。蜂膠中含有豐富的生物活性成分，具有廣泛的生理和藥理活性。但是不同地區甚至相同地區的蜂膠所含有的活性成分都有所差異，這主要是由于蜜蜂所采集的膠原植物不同所導致的。巴西蜂膠中富含萜類化合物和p-香豆酸異戊烯基衍生物；而在中國大陸及歐洲，蜂膠的主要成分是多酚類物質，其中包括酚酸和黃酮類物質[2]。而一般用于分析植物及其相關產品中的酚酸和黃酮類物質的方法有很多，比較常用的是高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)[3-4]。同時還可以串聯質譜進行物質的結構分析，這就使得這種方法在物質檢測和分析方面得到了很快的發展。

在中國，由于地理條件的關系，國內蜂膠的成分相當復雜。目前國家的行業標準，主要是檢測蜂膠中的8種黃酮，但是由于地域和膠源植物的差異，蜂膠的成分變化很大，例如8種黃酮中的蘆丁就只存在很小部分蜂膠中，并且含量很少。而且蜂膠的主要活性成分不僅僅是黃酮，還有酚酸和酚酸酯類，這些成分發揮著抗氧化、抗炎、抗癌等作用。然而目前的國家行業標準，沒有體現出這些生理活性物質。因此，通過檢測蜂膠中8種黃酮含量已無法完全滿足蜂膠質量評價和假膠鑒別要求[5]。

本實驗以北方11個省市所采集的蜂膠為原料，采用超聲波輔助乙醇水溶液法進行提取，之后利用HPLC檢測蜂膠提取物中的黃酮類和酚酸類物質，并通過聚類分析試圖反映出蜂膠的地域具有可追溯性。通過這些實驗可以更加有效的評價中國蜂膠及其相關產品的質量，對于實際生產具有重要指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑龍江、吉林、遼寧、北京、河北、山東、河南、陜西、安徽、湖北、甘肅11個地區的蜂膠原膠分別由當地蜂農采集，由中國農業科學院蜜蜂研究所提供，粉碎后凍存；3,4-二羥基苯甲酸、4-羥基苯甲酸、香草酸、咖啡酸、香蘭素、p-香豆酸、阿魏酸、3-羥基-4-甲氧基肉桂酸、苯甲酸、3,4-二甲氧基肉桂酸、肉桂醇、楊梅酮、桑色素、肉桂酸、山奈酚、異鼠李素、芹菜素、鼠李素、松屬素、短葉松素、柯因、咖啡酸苯乙酯、高良姜素、苯甲酰肉桂酯、蘆丁、槲皮素、木犀草素、柚皮素、黃岑素、花旗松素、染料木素、沒食子酸(以上均為色譜純)、Folin-Ciocalteu試劑 美國Sigma公司；甲醇(CR) 美國Fisher公司。

1.2 儀器與設備

WK-600A高速粉碎機 青州市精誠醫藥裝備制造有限公司；AL204型分析天平 梅特勒-托利多(上海)儀器有限公司；Milli-Q Intergral純水/超純水一體化系統 美國Merk Millipore公司；KQ-50DB型數控超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司；微量移液器 德國Eppendorf公司；UV-2100型紫外-可見分光光度計 UNICO(上海)儀器有限公司；HZS-H型水浴搖床 哈爾濱市東明醫療儀器廠；SY21-K型電熱恒溫水浴鍋 北京長風儀器儀表公司；LGJ-12真空冷凍干燥機 北京松源華興科技發展有限公司； LC-6AD高效液相色譜儀(配有二極管陣列紫外檢測器(PDA)、CTO-10A柱溫箱、SIL-自動進樣器、LCsolution數據處理系統) 日本島津公司； RE-2000A旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 蜂膠提取物的制備

準確稱取10g已粉碎的各地區蜂膠，置于500mL已稱質量的具塞錐形瓶中，分別加入200mL 75%乙醇溶液。40℃、100r/min水浴搖床中提取48h，每12h取出錐形瓶并置于超聲波清洗器中，超聲1h，共超聲4次。提取結束后，離心收集蜂膠不同提取液。旋轉蒸發濃縮后進行真空冷凍干燥，得到的固體提取物凍存備用。

1.3.2 標準對照品溶液配制

準確稱取一定量的3,4-二羥基苯甲酸、4-羥基苯甲酸、香草酸、咖啡酸、香蘭素、p-香豆酸、阿魏酸、3-羥基-4-甲氧基肉桂酸、苯甲酸、3,4-二甲氧基肉桂酸、肉桂醇、楊梅酮、桑色素、坎非醇、異鼠李素、芹菜素、鼠李素、松屬素、柯因、咖啡酸苯乙酯、高良姜素、苯甲酰肉桂酯，將其配成一定質量濃度的標準品儲備液。根據各種標準品的出峰時間及強度，進行相應的混合，混合后標準品的濃度在0.1～0.8mg/mL。利用混合標準品工作液進行定性和定量分析。

1.3.3 樣品中總多酚含量的測定[6]

標準曲線的建立：精確稱取0.005g沒食子酸，蒸餾水定容50mL，該標準質量濃度0.1mg/mL。準確量取上述標準液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL置于10mL容量瓶中，各加入6mL蒸餾水，搖勻，再加入0.5mL 2mol/mL福林酚試劑，充分搖勻。1min之后加入1.5mL碳酸鈉溶液(20g /100mL)，混勻定容，放置10min后在765nm處測定其吸光度，繪制標準曲線。樣品測定時根據不同蜂膠提取物的質量濃度不同取樣量也不同，但吸光度選取在0.2～0.8之間。樣品中總多酚用原膠中沒食子酸質量計算。

1.3.4 樣品中總黃酮含量的測定[7]

標準曲線建立：精確稱量0.01g蘆丁標準品，用60%乙醇溶液溶解，定容至100mL容量瓶中，得到質量濃度0.1mg/mL標準溶液。準確吸取標準溶液0、5、7、9、10、12mL置于25mL容量瓶中，加水補到12mL，搖勻，再加入5% NaNO2溶液1mL充分搖勻；放置6min之后加入10% Al(NO3)3溶液1mL搖勻；放置6min之后加入4.3% NaOH溶液10mL，充分搖勻，最后用60%乙醇溶液定容至25mL放置15min后，在波長510nm處測定其吸光度，繪制標準曲線。樣品測定時根據不同蜂膠提取物的質量濃度不同取樣量也不同，但吸光度選取在0.2～0.8之間。樣品中總黃酮用原膠中蘆丁質量計算。

1.3.5 HPLC分析條件[8]

Shim-Pack PREP-ODS(250mm×4.6mm，5μm)色譜柱；流動相：甲醇-水(含0.1%乙酸溶液）；流速：1.0mL/min；檢測溫度35℃；檢測波長280nm；進樣量10μL；所用的梯度洗脫程序如下：0～10min、18%～28%甲醇溶液，10～35min、28%～38%甲醇溶液，35～58min、38%～50%甲醇溶液，58～70min、50%～55%甲醇溶液，70～85min、55%～59%甲醇溶液，85～95min、59%～62%甲醇溶液，95～105min、62%～70%甲醇溶液，105～120min、70%～75%甲醇溶液，120～140min、75%甲醇溶液。

1.3.6 樣品中成分的初步定性

按照相同的色譜條件，分別對標準品混合物和不同地區的蜂膠提取液進行液相色譜分析。根據樣品中各個組分的保留時間和標準品的保留時間是否重合進行初步定性，然后進一步根據二極管陣列檢測器所得到的紫外光譜的形狀，吸收帶以及最大吸收波長與標準品的紫外光譜相比較，進行樣品定性分析。

1.3.7 樣品中各組分定量

將1.3.2節配制的混合對照品溶液，按1.3.5節色譜條件，分別以1、5、10、15、20、2 5μL進樣量，依次進樣分析。以對照品的進樣量(X)/(μg/L)對峰面積(Y)進行線性回歸分析。由標準曲線分別計算出各個產地蜂膠中各組分的含量。

1.3.8 數據處理

利用Excel繪制各對照品標準曲線，獲得線性回歸方程及相關系數；采用SPSS 13.0軟件對數據進行方差分析，分別比較總酚和總黃酮含量在不同提取物之間的顯著性差異，P＜0.05有統計學意義。利用Alphasoft軟件進行蜂膠區域性的聚類分析。

2 結果與分析

2.1 不同地區的蜂膠提取物中的總多酚和總黃酮含量

表1 不同地區蜂膠提取物的總多酚、總黃酮含量Table 1 Total polyphenol and total flavonoid contents in propolis extracts from different areas

從表1可知，不同地區蜂膠中的總酚酸和總黃酮含量不同，其中每克原膠的總酚酸含量范圍為81.19～199.69mg；總黃酮為139.55～368.06mg。其中河北地區的蜂膠提取物中總多酚含量最高，為(199.69±0.56)mg/g，而總黃酮含量最高的是陜西蜂膠提取物，為(368.06± 1.35)mg/g，但是通過數據分析可以看出，河北蜂膠中的黃酮含量和陜西蜂膠之間并沒有顯著差異，因而單從總體的活性成分上看，河北地區蜂膠可能是最好的，而吉林、安徽及湖北等地區的蜂膠相對較差。

不同地區蜂膠中的總多酚和總黃酮含量不同，主要與當地飼養的蜜蜂種類和蜂膠的膠原植物有關。總體含量與Ahn等[9]報道的中國和歐洲蜂膠中的總多酚和總黃酮含量相比差異不大。當然即使活性成分含量較少的吉林和安徽等地的蜂膠提取物，也比其他一些天然產物中的多酚含量要高，如龍眼(27.4mg/g)[10]。

2.2 液相色譜條件的確定

液相色譜的最佳條件是以相鄰的兩種物質可以明顯分開為最佳，因此本實驗進行多種流動相的選取。有機相從甲醇和乙腈中篩選，實驗結果發現，甲醇流動相基線和物質的分離情況更好，這可能是由于甲醇的水溶性和非極性相對較好。對于水相流動，通過添加一定的酸性物質進去，可以有效增加物質的溶解，阻止部分酚酸類和黃酮類物質的解離而出現掛柱，導致目標物質出現拖尾的現象。在水相中加入的酸性物質主要從磷酸、乙酸和甲酸3種物質中篩選。結果發現，添加酸性物質后，目標化合物拖尾現象明顯減少，且分離效果和峰型都得到了明顯改善，其中磷酸和乙酸效果最好，但考慮到所用的色譜柱子是反相色譜柱，同時有機相為甲醇，易使磷酸類物質結晶吸附在色譜柱上，對色譜柱產生一定的影響；并且在做質譜分析檢測時不能使用磷酸，所以本實驗選取乙酸作為酸性劑。

為了能夠獲得最佳的分離效果和最高的效率，對于酸性條件進行了篩選，發現0.2%和0.1%(V/V)的乙酸-水對峰型效果最好，但是考慮柱子耐受酸性程度，本實驗最終選擇0.1%(V/V)的乙酸-水為水相流動相。對于檢測波長來說，多酚類物質的最大吸收波長主要在280nm和350nm處，實驗結果顯示，在280nm處的紫外光譜吸收，較多的物質能夠被檢測出來，且基線相對比較平穩，所以本實驗選取280nm作為檢測波長。

實驗開始階段，首先進行等濃度洗脫，但是分離效果不好，這可能是由于蜂膠中的活性成分比較復雜，難以在一個濃度條件獲得相對較好的分離效果，之后參考了一些文獻[8,11-12]選擇了梯度分離，并進一步探索，得到一個相對較好的分離效果，所用分離條件如下：流動相：甲醇-水(含0.1%乙酸）；流速：1.0mL/min；檢測溫度35℃；檢測波長280nm；進樣量10μL；所用梯度洗脫程序如下：0～10min、 18%～28%甲醇，10～35min、28%～38%甲醇，35～58min、38%～50%甲醇，58～70min、50%～55% 甲醇，70～85min、55%～59%甲醇，85～95min、59%～62%甲醇，95～105min、62%～70% 甲醇，105～120min、70%～75%甲醇，120～140min、75%甲醇。

2.3 中國北部地區蜂膠成分分析

首先進行單個標準品的分析，通過相對保留時間和紫外光譜進行相應定性分析，將樣品中含有且相對能夠分開的標準物質進一步混合，得到了最終 23種物質的混合物。標準品混合物液相圖譜見圖1。

圖1 標準品HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatogram of mixed individual compound standards

圖2 不同地區蜂膠的HPLC圖譜比較Fig.2 Comparison of HPLC chromatogram fingerprints of propolis extracts from different areas

表2 不同地區蜂膠中各組分含量Table 2 Contents of individual components in propolis extracts from different areas

由圖2可知，各地的蜂膠提取物的主要成分多數集中在75～100min之間，在75min之前和100min之后蜂膠的成分含量較低。根據實驗結果，75min之前多為酚酸類物質，而在75～100min之間的多數是黃酮類物質，而100min之后可能是酯類物質。其中從液相圖譜的峰數可以看出，河南蜂膠提取物所含有的成分種類較多。結合表2可以看出，河北、黑龍江和河南蜂膠的成分種類最多，且以酚酸和黃酮類物質為主要成分。酚酸以咖啡酸和p-香豆酸最為普遍且含量也相對最多，其中河南蜂膠中咖啡酸含量最多，為11.18mg/g，而黑龍江蜂膠中p-香豆酸含量最多，為13.18mg/g。從表2可以看出，按照目前國家標準規定檢測蜂膠中的8種黃酮，其中坎非醇、芹菜素、松屬素、柯因、高良姜素最為普遍。在11種蜂膠中河南蜂膠的坎非醇、松屬素、柯因以及高良姜素最多，遼寧蜂膠中的芹菜素含量最大，分別為3.84、53.44、63.67、40.35、6.72mg/g。國家標準中規定的蜂膠中的8種黃酮類物質，只有這5種黃酮類物質普遍的存在于北方不同地區的蜂膠中，而楊梅酮存在的范圍較小且含量也相對較低；在所測的11個產地蜂膠中蘆丁、桑色素均未檢測到，這表明簡單的以這8種黃酮類物質來作為中國蜂膠的產品質量標準存在缺陷。除了上述5種黃酮，還檢測出鼠李素和異鼠李素，且含量也相對較高，其中山東蜂膠中鼠李素含量為10.73mg/g，遼寧蜂膠中異鼠李素含量為7.87mg/g。相比而言，酚酸類物質中咖啡酸和p-香豆酸普遍存在于所測的11個產地中，且含量也相對較高，此外苯甲酰肉桂酯和咖啡酸苯乙酯也比較普遍存在于所測定蜂膠中。因此在進一步增加檢測樣品量的基礎上，建議在修訂國家行業標準時，刪除蘆丁、桑色素和楊梅黃酮的檢測，增加鼠李素和異鼠李素，以及咖啡酸、p-香豆酸和咖啡酸苯乙酯的檢測。該結論為進一步完善中國蜂膠的質量標準提供一定理論支持。

由于不同地區的植物有著較大的區別，而蜂膠的成分主要依靠蜜蜂所采集的膠原植物的種類不同而有所不同，甚至同一地區的蜂膠，其所含有的化學成分都有著不同，使得蜂膠的植物來源性很難確定。Ahn等[9]研究發現中國蜂膠的主要成分是柯因、高良姜素、松屬素、短葉松素，這與楊樹膠的主要成分相同。同時從本實驗測定結果來看，所測定地區的蜂膠中都含有相對較高的柯因、高良姜素、松屬素和鼠李素含量，表明這些地區的蜂膠植物源性與楊樹可能有著較大的關系。此外，有些研究者還發現，中國、歐洲等北半球國家的蜂膠組成成分都與楊樹膠或其滲出液有著一定的相似性[13-15]，但是由于中國蜂膠主要以酚酸和黃酮類物質為主，所以一些黃酮類物質含量要高于歐洲一些國家，如柯因含量要高于保加利亞蜂膠(8.4mg/g)[2,16]。然而，Volpi等[17]研究結果卻顯示中國蜂膠中不含有坎非醇和柯因，這可能是由于所使用的分析方法不同，以及選用的蜂膠產地不同。

2.4 不同地區蜂膠的HPLC聚類分析

圖3是利用Alphasoft軟件，將HPLC檢測到的所有峰進行聚類分析得到的結果，它比單純的利用某幾個特定物質峰進行分析得到的結果更可靠，能更加全面的反應各地區蜂膠中的成分，進而有效的對蜂膠的區域源性進行分析。從圖3可知，河南和陜西蜂膠的主要成分具有很大的相似性，這表明這兩地的蜂膠的膠原植物具有一定的相似性；河北、山東和遼寧地區的蜂膠具有一定的相似性；但是北京地區的蜂膠成分卻與河北蜂膠有著很大的不同，這主要是由于膠原植物和采集時間不同所導致的，即使是同一地區的蜂膠其成分含量上也有著很大的不同，如北京市海淀區和門頭溝區的蜂膠成分[18]。 同樣，研究發現安徽、湖北、黑龍江、吉林以及甘肅這些地區的蜂膠，在模擬分析中有很大的相似性。雖然這些地區在地里位置上離的相對較遠，但膠原植物可能具有很大的相似性，使得這些地區的蜂膠具有很大的相似性。從以上實驗結果可以看出，蜂膠的區域性不可以簡單的以蜂膠的產地來劃分，而應以蜂膠所含有的組成成分來進行分析確定。

圖3 中國不同地區蜂膠相似度分析Fig.3 Similarity comparison of propolis samples from different areas

3 結 論

利用乙醇溶液對11個地區的蜂膠進行提取，測定其總多酚和總黃酮的含量，結果表明它們之間差別很大，其中河北地區的蜂膠提取物含有的總多酚含量最高，而總黃酮含量最高的是陜西蜂膠提取物，但在P＜0.05條件下，河北蜂膠中的黃酮含量和陜西的蜂膠之間并沒有顯著差異，相比較而言，吉林、安徽及湖北等地區的蜂膠含量相對較低，因此，單從總體的活性成分上看，河北蜂膠可能是最好的。

通過HPLC對蜂膠中有效成分進行定性和定量。結果顯示，蜂膠的主要成分是酚酸和黃酮類物質，此外還含有一些酯類和其他物質。酚酸中以咖啡酸和p-香豆酸最為普遍且含量也相對最多，其中河南和黑龍江的含量最多；黃酮以坎非醇、芹菜素，松屬素、柯因、高良姜素最為普遍，其中河南蜂膠提取物中含有坎非醇、松屬素、柯因以及高良姜素，遼寧蜂膠提取物中含有的芹菜素最大；酯類方面苯甲酰肉桂酯和咖啡酸苯乙酰酯較為普遍。這種方法為開發蜂膠保健功能食品和藥理學研究提供了理論基礎。

本實驗利用Alphasoft軟件對蜂膠的全組分進行了聚類分析，根據HPLC圖譜比較分析，可以發現河南和陜西蜂膠所含的成分種類最多，而北京和安徽等地的蜂膠成分種類含量相對較少。從實驗初步鑒定的成分含量上看，河南、河北和北京相對較多，其他省份相對較少。區域性分析結果顯示，河南和陜西具有很大的相似性，河北、山東和遼寧地區的蜂膠具有一定的相似性，安徽、湖北、黑龍江、吉林以及甘肅這些地區的蜂膠相似度較大，而北京地區的蜂膠與上述蜂膠相似度相對較小，這可能是由于所產膠的地域、季節、樹種、蜂種的差異所導致的。這也表明蜂膠的區域性不能夠簡單的以地理位置劃分，而應以蜂膠的所含有的組成成分進行分析確定。這為建立全國的蜂膠液相指紋圖譜打下一定基礎。

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Composition Analysis in Ethanol Extracts of Propolis Samples from Northern China

ZHAO Liang-liang1,2，WANG Guang-xin2，CHEN Ping1，DONG Jie2，ZHANG Hong-cheng2,*
(1. College of Food Science, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China；2. Bee Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100093, China)

The purpose of this study was to compare the contents of total phenols, total flavonoids and individual components in ethanol extracts of propolis samples collected from Northern China (Beijing and 10 provinces). The content of total flavonoids and total phenols were determined by NaNO2-Al(NO3)3 method and Folin-Ciocalteau method, respectively. Quantitative and qualitative HPLC analysis of phenols in propolis extracts was carried out by comparison with standard references for geographic cluster analysis of propolis samples. The results showed that the contents of total flavonoids and total phenols of propolis samples varied with geographic origin. The highest contents of caffeic acid, kaempferol, pinocembrin, chrysin, galangin and benzyl cinnamate were found in propolis samples from Henan province; propolis samples from Liaoning province were the richest in apigenin and isorhamnetin; propolis samples from Shandong province showed the highest content of rhamnetin.

propolis extract；HPLC；composition analysis

S896

A

1002-6630(2012)18-0143-06

2012-04-17

“十二五”國家科技支撐計劃項目(2011BAD33B04)；國家蜂產業技術體系資助項目(CARS-45-KXJ18)

趙亮亮(1988—)，男，碩士研究生，研究方向為食品科學。E-mail：zll.3678@163.com

*通信作者：張紅城(1967—)，男，副研究員，博士，研究方向為食品生物技術。E-mail：zzhc@sohu.com