滲濾法提取川貝母工藝的研究

楊遠(yuǎn)姍

滲濾法提取川貝母工藝的研究

楊遠(yuǎn)姍

目的篩選滲漉法提取川貝母總生物堿的最佳工藝。方法用正交實驗設(shè)計，以浸泡時間、滲漉速度、收集滲漉液體積、乙醇濃度為因素及條件進(jìn)行優(yōu)化;總生物堿中貝母辛作為評價指標(biāo)，HPLC法測定貝母辛。結(jié)果最佳提取工藝為70%乙醇浸泡24 h，滲漉速度為3 ml/(kg·min)，收集10倍的滲漉液，貝母辛提得率為0.016%。結(jié)論用70%乙醇12倍量浸漬24 h，滲漉速改為3 ml/(kg· min)提取的，貝母辛的含量明顯高于其他濃度。

正交實驗;滲漉法;川貝母;貝母辛;高效液相色譜法

川貝母為百合科貝母屬植物(Fritillaria cirrhosa D.Don)的干燥鱗莖，性苦、甘，微寒。歸肺、心經(jīng)。用于肺熱燥咳，干咳少痰，陰虛勞嗽，咯痰帶血［1］，是臨床上常用中藥材，主要有效成分為貝母生物堿，而貝母辛又是總生物堿的主要成分［2］，有多種方法提取川貝母生物堿［3，4］。本文報告以貝母辛含量為指標(biāo)、HPLC法測定、正交實驗設(shè)計、滲漉法提取貝母生物堿的工藝研究。

1 儀器與材料

2695/2996型高效液相色譜系統(tǒng)(美國Waters公司);瑞士Precisa電子天平(R 205SM-DR);CQX25-06超聲波清洗器(上海必能信超聲有限公司，250W，頻率25kHz);乙腈、二乙胺、氯仿、甲醇、氨色譜純;貝母辛對照品(批號:)，中國藥品生物制品檢定所提供;川貝母藥材購自一心醫(yī)藥公司(批號:20080209-Z)，屬2005年版《中國藥典》版一部百合科貝母屬植物川貝母(暗紫貝母F.unibracteata)的干燥鱗莖。

2 實驗方法與結(jié)果

2.1 正交試驗設(shè)計 以總生物堿中的貝母辛含量為考察指標(biāo)，實驗選擇四個因素分別為:浸泡時間、滲漉速度、收集滲漉液體積、乙醇濃度，以三水平正交表L9(34)安排實驗。

2.2 提取方法 取川貝母粗粉100 g，用不同濃度乙醇浸泡不同時間，進(jìn)行滲漉，收集滲漉液，減壓濃縮干燥，得干浸膏，備用于貝母辛的含量測定，乙醇濃度，浸泡時間、滲漉速度、收集滲漉液體積、見表1。

2.3 含量測定方法

2.3.1 色譜條件 色譜柱為Kromasil C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相:乙腈-水-乙胺 (42∶58∶0.03)，流速為1.0 ml/min，檢測波長為410 nm，工作電壓為+0.9 V。

2.3.2 對照品溶液的制備 精密稱取貝母辛對照品適量，

溶于甲醇中，制成濃度1 mg/ml對照品溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備 干燥后的提取物研成粗粉，精密稱取0.5 g置50 ml容量瓶中，加入甲醇約30 ml，放冷后，加甲醇定容，搖勻，后過濾，取續(xù)濾液10 ml，置50 ml容量瓶中，定容，搖勻，即可。

2.3.4 線性關(guān)系考察 精密量取“2.3.2”條下對照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml，置10 ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。取上述溶液注入液相色譜儀，照上述色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，以峰面積積分值 (Y)對進(jìn)樣量(X)作線性回歸，得回歸方程為Y=1.0625X+5.1217 r= 0.9997其范圍在0.032～1.15 mg/ml。

2.3.5 精密度試驗 精密吸取對照品溶液0.5 ml，按2.3.4中的方法處理后，連續(xù)測5次，計算RSD=0.56%。

2.3.6 穩(wěn)定性考察 取一試樣，按2.3.3處理后，用2.3.4中的方法，按 0、0.5、1、1.5、2 h分別測定，計算 RSD =2.12%。

2.3.7 重復(fù)性試驗 取同一試液5份，按2.3.3處理后，按2.3.4方法，分別測定，計算RSD=0.87%

2.3.8 加樣回收率試驗 精密吸取貝母辛對照品溶液適量，加在已知含量的樣品中，按2.3.4方法測定，計算回收率= 97.77%、RSD=1.19%。

2.4 樣品含量測定 取9份樣品，按供試液的方法處理后，按2.3.4測定，含量測定結(jié)果見表2。

2.5 正交實驗結(jié)果 由表2差值和表3的方差分析結(jié)果表明在四個因素中，對貝母辛提取率影響程度依次為:A＞C＞D ＞B。最佳提取的組合為 A2B1C2D2，即取川貝母粗粉用70%乙醇，浸泡 24 h，進(jìn)行滲漉，滲漉速度為 3 ml/(kg· min)，收集12倍滲漉液。

2.6 工藝驗證實驗 取川貝母粗粉100 g兩份，分別按照最佳滲漉工藝進(jìn)行實驗，將滲漉液減壓干燥。按2.3.4方法測定貝母辛的含量。結(jié)果見表4。

表1 因素與水平數(shù)

表2 滲漉工藝正交實驗結(jié)果

表3 苦參滲漉工藝方差分析

表4 川貝母滲漉工藝驗證實驗結(jié)果

3 討論

由表3極差值和表4的方差分析結(jié)果表明在4個因素中，浸泡時間和收集滲液體積對苦參堿提取率影響較大。在浸泡時間A因素中A2＞A3＞A1，故選A2，因素滲漉速度B對實驗結(jié)果無顯著影響，為加快提取速度選擇B1。對于因素乙醇濃度D，因為D2＞D3＞D1，故選擇 D2。在因素收集滲漉液體積C中C3＞C2＞C1，應(yīng)選C3。綜上，滲漉法提取川貝母總生物堿的最佳提取工藝為70%乙醇浸泡24 h，滲漉速度為3 ml/(kg·min)，收集12倍的滲漉液，提得率為0.016%。報道，紫貝母的貝母辛量含量為0.020%［5］。

報道提取川貝母生物堿的乙醇濃度為60% ～80%［6，7］，在正交試驗前，曾預(yù)試用65、75、85、95%乙醇8～12倍量浸漬24 h，滲漉速度為1～3 ml/(kg·min)，結(jié)果表明用70%乙醇12倍量浸漬24 h，滲漉速度為3 ml/(kg·min)，提取時，貝母辛的含量明顯高于其他濃度，故正交試驗中選擇2.1水平進(jìn)行試驗。

在貝母辛的含量測定中，《中華人民共和國藥典》沒有含量測定項目，有報道以HPLC法測定［5，8］，經(jīng)對系統(tǒng)條件摸索，以2.3.1效果較好，故本實驗選用高效液相法。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部).北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:25．

［2］馬利瓊，王曉銘.17個不同產(chǎn)地的川貝母總生物堿的含量測定．華西藥學(xué)雜志，2001，16(1):60-61．

［3］張良，袁瑜，李玉鋒.CO2超臨界萃取川貝母游離生物堿工藝研究．西華大學(xué)學(xué)報，2008，27(1):39．

［4］蔡治綱，趙宏，毛曉敏，等.川貝母提取工藝研究．江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2005，17(1):46-47．

［5］余華，姜艷，李萍，等.中藥川貝母定量分析方法研究．中國中藥雜志，2005，30(8):572．

［6］蔡治綱，趙宏，毛曉敏，等.川貝母提取工藝研究．江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2005，31:46．

［7］陳萍，朱胤龍，韋強，等.均勻設(shè)計法優(yōu)選川貝母滲濾提取工藝．中國實驗方劑學(xué)雜志，2003，9(3):12．

［8］晁若冰，胡玲.高效液相色譜法測定貝母中貝母辛的含量．藥學(xué)學(xué)報，1993，28(9):105．

Optimiztion of the percolation processes of bulbus fritillariae cirrhosaet by othogonal design

YANG Yuan-shan．People's Hospital of Guangxi，Yizhou 546300，China

ObjectiveTo optimize the best extraction conditions of total alkaloids in Sophora Root by percolation.MethodsComparing the content of peimisine the alcohol concentration，soak time，velocity and volume were investigated by orthogonal experiment and HPLC to measure peimisine.Results The optimum Percolation extracting condition obtained:soaked with 70%alcohol for 24 h，adding 10 folds of 70%alcohol at speed of 3 ml/(kg·min).Extraction yield of peimisine 0.016%．Conclusion Using 70%ethanol with 12 times the volume of dipping 24 h，percolation rate is 3 ml/(kg·min)extraction，PEIMISINE content was higher than that of other concentration．

Orthogonal design;Percolation;Bulbus Fritillariae Cirrhosaet;peimisine;HPLC

546300廣西宜州市人民醫(yī)院