地瓜藤提取物對酪氨酸酶的激活作用

熊麗丹，李利

（1.四川省化妝品工程技術(shù)研究中心，四川 成都 610041；2.四川華膚生物科技有限責(zé)任公司，四川 成都 610041；3.四川大學(xué)華西醫(yī)院皮膚科，四川 成都 610041）

地瓜藤為?？崎艑俣嗄晟淙~匍匐灌木植物地瓜榕FicustikouaBur.的莖、葉，性味苦、寒，歸肺、肝、脾經(jīng)。主要功能為清熱利濕，通絡(luò)，消腫，用于慢性支氣管炎、痢疾、小兒消化不良、風(fēng)濕疼痛、無名腫毒、膿皰瘡、疥癬[1-2]。地瓜藤廣范分布于我國的四川、廣西、貴州、湖南等地，多野生，在川、桂、黔等地作為民間習(xí)用藥材，常用鮮品搗敷外用，治無名腫毒、湯火傷。目前關(guān)于地瓜藤的研究極少，僅關(guān)永霞等[3]對其化學(xué)成分進(jìn)行了研究，已知地瓜藤的提取物中含有呋喃香豆素類物質(zhì)，而祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)用含呋喃香豆素類藥物治療白癜風(fēng)的歷史悠久，長期的臨床實(shí)踐證明含呋喃香豆素類藥物對白癜風(fēng)的治療效果明顯[4]。但尚未見地瓜藤治療白癜風(fēng)的報(bào)道。

白癜風(fēng)是一種臨床較常見的色素脫失性皮膚病，發(fā)病率為 0.5% ～2%[5]。研究發(fā)現(xiàn)，酪氨酸酶（Tyrosinase，TYR）活性降低是白癜風(fēng)患者皮膚黑素合成受阻的重要因素。TYR是皮膚黑素生物合成的主要限速酶，其活性與黑素合成量呈正相關(guān)，調(diào)節(jié)TYR的活力即可控制黑素生成量，影響著白癜風(fēng)的治療效果。本實(shí)驗(yàn)采用蘑菇酪氨酸酶多巴速率氧化法，對地瓜藤激活TYR的作用進(jìn)行研究，為采用地瓜藤治療白癜風(fēng)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

KQ-300VDE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司）；DNP-9025型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

地瓜藤植物樣品采集于四川省簡陽市郊區(qū)，經(jīng)四川大學(xué)張浩教授鑒定為地瓜藤FicustikouaBur.，藥用部位為莖、葉；補(bǔ)骨脂購自四川新荷花中藥飲片有限公司，經(jīng)四川大學(xué)張浩教授鑒定為補(bǔ)骨脂PsoraleacorylifoliaL.，藥用部位為果實(shí)；酪氨酸酶（貨號 T3824）和 L-多巴（貨號 D9628）購自美國Sigma公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1 中藥乙醇提取物的制備

地瓜藤鮮品、補(bǔ)骨脂干燥果實(shí)各200 g，分別用70%的乙醇室溫下密閉浸泡2周，并不時(shí)振蕩。濾過除渣收集乙醇提取液置60℃水浴中濃縮至浸膏狀。用40 mL二甲基亞砜溶解后置4℃冰箱凍存?zhèn)溆?。臨用時(shí)用1／15 mol·L-1、pH 6.8磷酸緩沖液稀釋至設(shè)定濃度。

2.2 酪氨酸酶活性測定[6]

將中藥提取物用1／15 mol·L-1、pH 6.8磷酸緩沖液稀釋后與蘑菇酪氨酶1 mL（100 U）混合，25℃孵育10 min。加入0.15%L-多巴反應(yīng)液1 mL，繼續(xù)孵育2 min，立即于分光光度計(jì)475 nm處測光吸收值A(chǔ)475。提取物的濃度設(shè)定為6，4，2，1，0.2 mg·mL-1。取5個(gè)濃度的補(bǔ)骨脂提取液為藥物參比對照，每一實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。最后計(jì)算酪氨酸酶的激活率，酪氨酸酶激活率（%）＝[（C-D）-（A-B）]／（AB）×100，其中 A：PBS+L-DOPA+TYR；B：PBS+L-DOPA；C：中藥 +L-DOPA+TYR；D：中藥+L-DOPA+PBS。

2.3 不同溶劑對乙醇提取物萃取及各萃取物對酪氨酸酶激活率的測定

地瓜藤鮮品200 g，用70%的乙醇室溫下密閉浸泡2周，并不時(shí)振蕩。濾過除渣收集乙醇提取液置60℃水浴中濃縮至無醇味。將地瓜藤乙醇提取濃縮液依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇進(jìn)行萃取，每種萃取劑萃取3次，常壓蒸餾濃縮，揮干溶劑。取各萃取物1g，用二甲基亞砜溶解后，再用1／15 mol·L-1、pH 6.8磷酸緩沖液定容于 1 L容量瓶中，配成1 mg·mL-1的溶液，按2.2所述方法測定其對酪氨酸酶的激活率。

2.4 地瓜藤影響酪氨酸酶活性的動(dòng)力學(xué)研究

在一定量的1／15 mol·L-1、pH 6.8的磷酸緩沖液中，加入不同劑量的L-DOPA為底物和0.2 mL的地瓜藤萃取物后，于25℃孵育10 min，快速加入50μL酪氨酸酶溶液，即刻記時(shí)，觀察分光光度計(jì)475 nm處1 min時(shí)的吸光度（A475），最終反應(yīng)體系為3.0 mL，以雙蒸水作為實(shí)驗(yàn)空白對照，根據(jù)產(chǎn)物的消光系數(shù)測得酶活力。采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法制得酶動(dòng)力學(xué)曲線，通過所得直線求出激活劑作用下的表觀米氏常數(shù)（Kmapp）和表觀最大反應(yīng)速度（Vmapp），與不加地瓜藤萃取物（以雙蒸水作為空白對照）時(shí)原始的Km和Vmax進(jìn)行比較，以判定激活劑作用于底物和酪氨酸酶的方式。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法

所測實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)處理，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素ANOVA方差分析LSD進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

3 結(jié)果

3.1 地瓜藤乙醇提取物對酪氨酸酶活性的影響

5個(gè)濃度的地瓜藤提取物對酪氨酸酶的激活率都為正值，表明5個(gè)濃度的地瓜藤提取物對酪氨酸酶均有不同程度的激活作用。與0.2 mg·mL-1補(bǔ)骨脂提取物對照組比較，濃度為1 mg·mL-1的地瓜藤提取物對酪氨酸酶的激活調(diào)控作用最為顯著，達(dá)64.58%；濃度在2 mg·mL-1時(shí)，具較明顯的酪氨酸酶激活作用，為49.43%；濃度為0.2，4，6 mg·mL-1對酪氨酸酶調(diào)控?zé)o明顯激活作用，但均未產(chǎn)生抑制作用。而作為治療白癜風(fēng)的常用中藥補(bǔ)骨脂在低濃度對酪氨酸酶具激活作用，在高濃度對酪氨酸酶具抑制作用。補(bǔ)骨脂提取物隨濃度的增加，對酪氨酸酶激活作用逐漸降低，當(dāng)濃度達(dá)4 mg·mL-1時(shí)表現(xiàn)出抑制作用。結(jié)果見表1。

表1 乙醇提取物對酪氨酸酶活性的影響（±s，n＝3）

表1 乙醇提取物對酪氨酸酶活性的影響（±s，n＝3）

注：與對照藥物0.2 mg·mL-1濃度組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

／%地瓜藤乙醇提取物名稱 濃度／mg·mL-1 激活率64.58±0.627**249.43±0.349*420.41±1.1166 9.25±1.162*補(bǔ)骨脂乙醇提取物 0.237.14±0.2321 29.02±0.1392 9.95±0.2564-5.45±0.4190.234.28±0.3721-13.69±0.2096

3.2 各萃取物對酪氨酸酶的激活作用

石油醚、乙酸乙酯、正丁醇3種溶劑對地瓜藤乙醇提取物萃取，所得各萃取物對酪氨酸酶的激活作用，在濃度為1 mg·mL-1時(shí)激活率均為正值，表明4種萃取物對酪氨酸酶均有不同程度的激活作用。乙酸乙酯萃取物對酪氨酸酶的激活調(diào)控作用最為顯著，為84.30%；石油醚萃取物、正丁醇萃取物對酪氨酸的激活率分別為68.88%、38.24%。結(jié)果見圖1。

圖1 地瓜藤萃取物對酪氨酸酶激活率的影響（±s，n＝3）

3.3 地瓜藤影響酪氨酸酶活性的動(dòng)力學(xué)分析

與不加地瓜藤萃取物時(shí)原始的Km和Vmax相比，地瓜藤石油醚萃取物的Km值基本不變，Vmax增大，為非競爭性激活作用，表明石油醚萃取物所含活性成分在酶促反應(yīng)體系中，激活酪氨酸酶的方式是提高酶促反應(yīng)的速率完成的；地瓜藤乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物的Km降低，Vmax增大，為混合型激活作用，表明乙酸乙酯和正丁醇萃取物在酶促反應(yīng)體系中，通過影響底物與酶的結(jié)合，改變酶的空間構(gòu)型，從而提高酶與底物的親和力，并能提高反應(yīng)速度。結(jié)果見圖2、表2。

圖2 地瓜藤萃取物對酪氨酸酶的激活類型（±s，n＝3）

表2 地瓜藤萃取物對酪氨酸酶活性作用的動(dòng)力學(xué)分析（±s，n＝3）

表2 地瓜藤萃取物對酪氨酸酶活性作用的動(dòng)力學(xué)分析（±s，n＝3）

萃取物 常數(shù)測定Km V激活類型max 0.77±0.0447.77±0.48石油醚萃取物 0.78±0.0375.19±0.97 非競爭性乙酸乙酯萃取物 0.69±0.05135.25±4.92 混合型正丁醇萃取物 0.58±0.0261.24±1.49對照混合型

4 討論

人體膚色深淺主要取決于表皮中黑素細(xì)胞（Melanocyte，MC）合成的黑素量、大小及種類[7]。正常情況下，MC通過其樹狀突將胞內(nèi)合成的黑素輸送到基底細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞中，形成皮膚顏色并發(fā)揮保護(hù)細(xì)胞免受紫外線損傷的作用。白癜風(fēng)是臨床較常見的色素脫失性皮膚病，與表皮中MC代謝異常密切相關(guān)，酪氨酸酶活性降低是白癜風(fēng)患者皮膚黑素合成受阻的重要因素。中藥治療白癜風(fēng)等色素減退性皮膚病已經(jīng)成為目前研究的熱點(diǎn)，藥物可以通過提高皮膚內(nèi)酪氨酸酶的活性，增加黑素的合成，從而治療白癜風(fēng)。本實(shí)驗(yàn)著重探討了地瓜藤對酪氨酸酶的激活作用，并對其進(jìn)行系統(tǒng)的提取、分離和分析，以期得到對酪氨酸酶有較好激活效果的有效成分，為今后治療白癜風(fēng)等色素減退性皮膚病提供基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)研究表明，地瓜藤的乙醇提取物對酪氨酸酶確有相當(dāng)明顯的激活作用，激活率最高可達(dá)64.58%，而且并非隨濃度的變化呈線性變化，濃度超過一定的程度時(shí)，對酪氨酸酶的激活作用逐漸降低，其中的機(jī)理目前尚不清楚。在各萃取物對酪氨酸酶激活作用研究中發(fā)現(xiàn)，乙酸乙酯萃取物、石油醚萃取物對酪氨酸的激活率分別為84.30%、68.88%，比在相同濃度下地瓜藤乙醇提取物對酪氨酸酶的激活率分別提高了19.72%、4.30%。因此，選用乙醇為提取劑，再用乙酸乙酯萃取，能夠在地瓜藤中提取到較多活化酪氨酸酶的活性成分。在本實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，地瓜藤萃取物中含有的活性物對酪氨酸酶具非競爭性激活和混合型激活多重激活作用，由此推測地瓜藤含有的活性物質(zhì)既能提高酶促反應(yīng)的速率，又能與酶分子上的基團(tuán)結(jié)合，改善酶的空間構(gòu)型，提高酶的親和力，從而使酶的基團(tuán)更好地與底物絡(luò)合。

地瓜藤資源豐富，為民間習(xí)用藥材，其促進(jìn)酪氨酸酶活性的藥理作用尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究為臨床治療白癜風(fēng)提供了思路，但其所具有的臨床應(yīng)用價(jià)值將有待于進(jìn)一步研究。