蛇床及其近緣物種的ITS2分子鑒定△

殷秀梅，羅焜，劉美子，羅紅梅*

（1.瀕危藥材繁育國家工程實驗室，中國醫學科學院北京協和醫學院藥用植物研究所，北京 100193；2.西南大學園藝園林學院，重慶 400716）

蛇床子為我國傳統中藥， 《中國藥典》記載其來源為傘形科植物蛇床Cnidiummonnieri（L.）Cuss.的干燥成熟果實，具有燥濕祛風，殺蟲止癢，溫腎壯陽的功能，用于陰癢帶下，濕疹瘙癢，濕痹腰痛，腎虛陽痿，宮冷不孕等[1]?，F代藥理學研究表明蛇床子的藥理作用廣泛，有抗心律失常、降血壓、血脂、鎮靜催眠、治療骨質疏松、抗菌、止癢、抗炎、抗腫瘤、抗氧化等作用[2-5]。藥用植物蛇床的近緣物種，主要包括同屬植物興安蛇床Cnidiumdauricum（Jacquin）Fischer ＆ C.A.Meyer，同科植物毒芹CicutavirosaLinn.、粗糙獨活HeracleumscabridumFranch.和旱芹ApiumgraveolensLinn.。這些近緣物種在外形上與藥用植物蛇床極為相似，但藥效卻完全不同。如毒芹，全草有毒，人畜誤食往往發生急性中毒或死亡。

DNA條形碼技術是利用基因組中一段公認標準的、相對較短的DNA片段來進行物種鑒定的新方法。由加拿大分類學家Paul Hebert首次提出，隨后引起學術界的廣泛關注[6-7]。ITS2作為DNA條形碼序列，因其兩端具有保守區便于通用引物設計，序列擴增容易，變異位點充足等優點，而被廣泛應用于動植物物種鑒定[8]。本研究選用ITS2序列對蛇床及其近緣物種進行鑒定研究，分析蛇床子基原植物與近緣物種之間的變異性，進化樹中物種的聚類情況，以及ITS2序列二級結構的差異，以期建立蛇床及其近緣物種鑒定的新方法，確保臨床用藥安全。

1 材料與方法

1.1 材料

蛇床新鮮葉片采自中國醫學科學院藥用植物研究所廣西分所藥用植物園，標本號PS1219MT01（GenBank登錄號JF421487）。蛇床子基原植物及近緣物種毒芹Cicutavirosa、旱芹Apiumgraveolens、粗糙獨活Heracleumscabridum、興安蛇床Cnidium dauricum的ITS2序列下載于GenBank數據庫，蛇床及其近緣物種信息見表1。

表1 蛇床及其近緣物種材料信息

1.2 樣品DNA提取、PCR擴增和測序

采用植物 DNA提取試劑盒（Tiangen Biotech Co.，China）提取DNA。ITS2序列的PCR擴增及測定方法均參考Chen等的研究[8]。

1.3 數據分析

測序獲得的峰圖利用CodonCode AlignerV3.7.1（CodonCode Co.，USA.）校對拼接以獲得可用于后續分析的ITS2序列。實驗數據與GenBank下載的ITS2序列均采用基于隱馬爾可夫模型的HMMer注釋方法去除兩端5.8S和26S區段獲得ITS2間隔區序列[9]。通過MEGA5.0軟件對不同樣本進行序列對比和遺傳距離分析，并重構其NJ系統發育樹?；赟chultz等[9]的研究預測各物種ITS2二級結構。

2 結果與分析

2.1 蛇床種內ITS2序列變異分析

蛇床的4條參考序列比對后長度為221 bp，GC含量范圍為57.5% ～57.9%，平均 GC含量為57.7%。含有1個POLY‘G’結構（大于等于5個單堿基重復），變異位點4處，分別為19位點的AG變異，77，145位點的C-T變異和217位點的A-T變異。蛇床種內平均K2P距離為0.0098，種內最大K2P距離為0.018，種內ITS2序列變異較小。

2.2 蛇床種間ITS2序列變異分析

蛇床與其近緣物種間序列進行比對后長度為230 bp，GC含量范圍為52.9%～57.9%，平均GC含量為56.4%。種間ITS2序列變異較大，ITS2序列間存在較多的變異位點（圖1）。蛇床種間平均K2P距離為0.2291，種間最小 K2P距離為 0.133，為蛇床（JF421487）和同屬植物興安蛇床（AY330508），見表2。

圖1 蛇床與近緣物種的種間ITS2序列比對

表2 蛇床種間K2P遺傳距離

2.3 聚類分析

從基于ITS2條形碼序列構建的蛇床與其近緣物種的NJ樹（圖2）可以看出，蛇床不同來源的樣品聚為一支，后又與同屬植物興安蛇床Cnidium dauricum聚為一支。其近緣物種毒芹Cicutavirosa、粗糙獨活Heracleumscabridum、旱芹Apiumgraveolens均獨立為一支。從NJ樹圖可以看出蛇床能與其近緣物種明顯區分開。

圖2 基于ITS2序列構建的蛇床與其近緣物種的NJ樹

2.4 蛇床及其近緣物種ITS2序列二級結構比較

如圖3所示，蛇床與其近緣物種的ITS2二級結構均有螺旋（Helix）Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，蛇床與其近緣物種在螺旋Ⅱ和螺旋Ⅳ上較為保守，在螺旋Ⅰ和螺旋Ⅲ上具有差異。結果顯示，ITS2二級結構能有效的區分蛇床及其近緣物種。

圖3 蛇床與其近緣物種的ITS2二級結構圖

3 討論

近年ITS2作為DNA條形碼序列在很多植物鑒定研究中取得良好效果。Chen[8]等對753屬4800種藻類、真菌和植物的6600條ITS2序列進行分析，發現其種級水平鑒定效率達到92.7%。ITS2對于不同科屬如薔薇科、豆科、蕓香科、黃芪屬、重樓屬等都有較好的鑒定效果[10-14]。此外，ITS2在大青葉、黨參、京大戟等藥用植物的鑒定中，均能將基原植物及其近緣物種和混偽品區別開[15-19]。

蛇床及其各近緣物種ITS2序列長度范圍為221～229 bp，序列間存在較多的變異位點，無插入／缺失變異。蛇床種內最大K2P距離0.018，種間最小K2P距離0.133，種間最小K2P距離遠大于蛇床種內K2P距離。蛇床與其同屬植物興安蛇床的變異位點相對較少，親緣關系較近，而與同科近緣物種種間變異較大。通過NJ樹聚類分析及ITS2二級結構比較，均能將蛇床與其近緣物種明確區分。本研究證實了ITS2序列鑒別蛇床與其近緣物種的可行性，同時為中藥材鑒別研究提供了新思路。