有機溶劑對多聚半乳糖醛酸酶催化動力學的影響

劉小林，李曉婷，龔國勇，黃 磊，黃卓烈，伍志權，黎春怡

(1.宜春學院生命科學學院，江西 宜春 336000；2.華南農業大學生命科學學院，廣東 廣州 510642；3.江西宜春中學，江西 宜春 336000)

有機溶劑對多聚半乳糖醛酸酶催化動力學的影響

劉小林1,2，李曉婷1，龔國勇1，黃 磊3，黃卓烈2，伍志權2，黎春怡2

(1.宜春學院生命科學學院，江西 宜春 336000；2.華南農業大學生命科學學院，廣東 廣州 510642；3.江西宜春中學，江西 宜春 336000)

以水溶性低分子質量殼寡糖作為修飾劑對已純化的多聚半乳糖醛酸酶進行化學修飾，得到化學修飾酶。再以有機溶劑甲醇、乙醇、丙酮、四氫呋喃為效應物，果膠為反應底物，研究其在緩沖液和不同有機溶劑中多聚半乳糖醛酸酶(PG)及其化學修飾酶(COS-PG)的動力學性質。結果表明：修飾后，在緩沖液中COS-PG的Km值有所下降，Vmax上升。在2%的甲醇、乙醇處理后，PG和COS-PG的Km和Vmax均下降。在2%四氫呋喃處理后，PG和COS-PG的Km和Vmax均上升。在2%丙酮處理后，PG和COS-PG的Km上升，而Vmax下降。

多聚半乳糖醛酸酶；有機溶劑；動力學

多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase，EC3.2.1.15，PG)是降解植物果膠骨架結構的主要酶之一[1]，能隨機地從多聚半乳糖醛酸內部打開α-1,4-糖苷鍵，產生聚合度為10～14的寡聚半乳糖醛酸[2]，與植物果實的軟化，脫落和種子成熟，植物組織的抗病性有關[3-6]。此外，PG在食品工業、農業、化妝品業、造紙業等領域也有廣泛的應用，是當今國際研究領域的熱點。

酶促反應動力學是研究酶促反應速度的規律及某些因素對酶促反應速度影響的科學。這對于了解酶的作用機制、確定有效的酶促反應環境有著十分重要的作用。Km值是酶的特征性常數，測定Km值是研究酶促反應動力學的一種重要方法。有機相中酶促反應的過程、機制與水相中是相同的，符合米氏方程、乒乓反應機制[7-8]。研究表明，影響有機介質中酶促反應動力學變化的因素涉及底物和溶劑的性質[7-9]。酶和溶劑競爭底物，如果底物與溶劑的親和性高，則底物與酶的親和力低，Km值就大；如果底物與溶劑的親和力低，酶和底物的親和力高，Km值就小。

近10幾年來，多聚半乳糖醛酸酶的分子生物學研究進展很快，主要集中在多聚半乳糖醛酸酶及其序列特征、多聚半乳糖醛酸酶基因及其序列特征、多聚半乳糖醛酸酶的表達調控以及與病原真菌致病力之間的關系等方面[10-13]。孫沈魯等[14]探討了高壓脈沖電場(pulsed electric fields，PEF)對多聚半乳糖醛酸酶活性及構象影響，研究表明，PEF處理可以有效地抑制PG的活性，隨著電場強度和脈沖個數的增加，酶活下降幅度增大。同時，PEF作用使酶的三級結構發生了明顯的變化。程桂平等[15]研究了pH值、溫度和金屬離子對內切多聚半乳糖醛酸酶(endo-PG)降解香蕉果膠多糖的影響。劉小林等[16]研究了EDTA和金屬離子對多聚半乳糖醛酸酶酶活力及其動力學的影響。但至今少見有報道有機溶劑對PG及其化學修飾酶動力學的影響研究。

本實驗主要研究PG和PG用水溶性低分子質量殼寡糖(chitosan oligosaccharide，COS)進行化學修飾后得到的化學修飾酶COS-PG在水溶性有機溶劑中的動力學參數變化，旨在為了解PG和COS-PG在水溶性有機溶劑中酶促催化反應變化的機理提供依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

多聚半乳糖醛酸酶(PG)、考馬斯亮藍G-250 美國Fluka公司；橘子果膠(純度99%) 美國Sigma公司；其他試劑是國產分析純。

HWS24型電熱恒溫水浴渦 上海益恒實驗儀器有限公司；LRH-150生化培養箱 上海一恒科學儀器有限公司；UV2000紫外-可見分光光度計 上海Unico公司。

1.2 方法

1.2.1 蛋白質含量測定

參照Bradford[17]的方法，以牛血清白蛋白為標準。

1.2.2 酶活力測定

參照王小敏等[18]的方法進行改進：酶促反應體系為pH4.0，反應溫度55℃，反應時間30min，采用DNS法測定生成的半乳糖醛酸量，在上述反應條件下，每分鐘產生1μg半乳糖醛酸的酶量定義為1個單位多聚半乳糖醛酸酶酶活力(U)。

1.2.3 多聚半乳糖醛酸酶(COS-PG)的活化及制備

參照Gomez等[19]的方法，采用高碘酸鈉氧化法對酶進行活化。稱取80mg多聚半乳糖醛酸酶溶于磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(pH4.0)中，將一定量的高碘酸鈉溶于5mL蒸餾水中。上述活化體系置于一定溫度培養箱內避光反應30min后，加入400μL乙二醇，迅速混勻后靜置2h，用3.0L緩沖液(pH4.0)透析過夜，得到活化的PG。

將活化后的多聚半乳糖醛酸酶中加入150mg殼寡糖，置于活化溫度下避光攪拌反應12h，不斷攪拌，緩慢加入20mg NaBH4終止反應，靜置2h后，用3.0L緩沖液(pH4.0)透析過夜。得到殼寡糖修飾的COS-PG。

1.2.4 動力學參數測定

參照林建成等[20]的方法，將PG置于含有磷酸氫二鈉-檸檬酸的緩沖液(pH4.0)中和含有不同體積分數有機溶劑(包括甲醇、乙醇、丙酮、四氫呋喃)的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(pH4.0)中，55℃水浴預保溫5min，加入0.1mL PG和COS-PG，并使反應體系中有機溶劑的終體積分數達到2%，參照1.2.2節方法，在磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(pH4.0)中，55℃條件下測定其酶活力，以底物質量濃度的倒數(1/[S])為橫坐標，以酶促反應速率的倒數(1/V)為縱坐標，繪制Lineweaver-Burk曲線，計算出Km值和Vmax值。果膠的質量濃度設置為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mg/mL和1.6mg/mL。

2 結果與分析

2.1 緩沖液中PG和COS-PG的動力學

圖1 PG和COS-PG在緩沖液中的Lineweaver-Burk曲線Fig.1 Lineweaver-Burk curves of PG and COS-PG in buffers

經在緩沖液中保溫1h后測定，PG和COS-PG的Lineweaver-Burk曲線見圖1，根據雙倒數作圖法計算求出PG的Km為3.68mg/mL，Vmax為526.32U/mg pro。COS-PG的Km為2.80mg/mL，Vmax為555.56U/mg pro。修飾后，COS-PG的Km下降，Vmax上升，可見，修飾后酶對底物的親和力和最大反應速率都上升。

2.2 PG和COS-PG在2%甲醇中的動力學

圖2 PG和COS-PG在2%甲醇中的Lineweaver-Burk曲線Fig.2 Lineweaver-Burk curves of PG and COS-PG in 2% methanol

在2%甲醇中PG和COS-PG的Lineweaver-Burk曲線如圖2所示。根據雙倒數作圖法計算求出PG的Km為2.17mg/mL，Vmax為434.78U/mg pro。COS-PG的Km為2.50mg/mL，Vmax為500.00U/mg pro。與緩沖液中相比，在2%甲醇中，PG和COS-PG的Km和Vmax下降。可見，在2%的甲醇中，PG和COS-PG與底物的親和力上升，最大反應速率下降。

2.3 PG和COS-PG在2%乙醇中的動力學

圖3 PG和COS-PG在2%乙醇中的Lineweaver-Burk曲線Fig.3 Lineweaver-Burk curves of PG and COS-PG in 2% ethanol

在2%乙醇中PG和COS-PG的Lineweaver-Burk曲線見圖3。根據雙倒數作圖法計算求出PG的Km為3.25mg/mL，Vmax為294.12U/mg pro。COS-PG的Km為2.17mg/mL，Vmax為434.79U/mg pro。與緩沖液中相比，在2%乙醇中，PG和COS-PG的Km和Vmax下降。可見，在2%的乙醇中，PG和COS-PG與底物的親和力上升，最大反應速率下降。

2.4 PG和COS-PG在2%丙酮中的動力學

圖4 PG和COS-PG在2%丙酮中的Lineweaver-Burk曲線Fig.4 Lineweaver-Burk curves of PG and COS-PG in 2% acetone

在2%丙酮中PG和COS-PG的Lineweaver-Burk曲線見圖4。根據雙倒數作圖法計算出PG的Km為4.28mg/mL，Vmax為357.14U/mg pro。COS-PG的Km為4.34mg/mL，Vmax為434.78U/mg pro。與緩沖液中相比，在2%丙酮中，PG和COS-PG的Km上升，而Vmax下降。可見，在2%的丙酮中，PG和COS-PG與底物的親和力下降，最大反應速率下降。

2.5 PG和COS-PG在2%四氫呋喃中的動力學

在2%四氫呋喃中PG和COS-PG的Lineweaver-Burk曲線見圖5。根據雙倒數作圖法計算求出PG的Km為5.00mg/mL，Vmax為625.00U/mg pro。COS-PG的Km為3.75mg/mL，Vmax為625.00U/mg pro。與緩沖液中相比，在2%四氫呋喃中，PG和COS-PG的Km和Vmax均上升。可見，在2%的四氫呋喃中，PG和COS-PG與底物的親和力下降，最大反應速率上升。

3 討論與結論

Km值是酶的特征性常數，一般只與酶的性質有關，而與酶的濃度無關。Km值的大小反映了酶和底物親和力的強弱，如果修飾Km值變大，說明酶與作用底物的親和力減小，Km值變小，說明酶與底物的親和力增強。

本實驗結果表明，COS-PG的Km值有所下降，Vmax有較大幅度的上升，可見，修飾后酶活性的提高主要是由于酶的最大反應速率和酶分子對底物的親和力增加共同作用而引起的。這可能是由于一方面偶聯到蛋白質表面的殼寡糖與蛋白質分子上的－OH基團形成氫鍵，使維持蛋白質高級結構的氫鍵受到部分的破壞，使亞基肽鏈結構趨于松散，從而降低了酶催化反應過程中酶分子構象改變所需要的化學能[21]，因此表現為Vmax大幅度上升；另一方面，殼寡糖引入酶蛋白表面后，增加酶分子表面的－，從而影響了整個酶活性中心的電荷分布，更有利于酶分子結合底物分子，因而表現為Km值有所下降，酶對底物的親和力上升。

在有機溶劑中，酶的動力學參數受有機溶劑的制約，與有機溶劑的濃度以及底物溶劑化有很大關系。有機溶劑可以通過改變底物和產物在有機溶劑與酶活性部位微水相之間的分配來影響酶的活力。這種分配效應可以用來解釋當酶從水溶液轉移到有機溶劑中時引起的表觀Km值增大。酶的催化效率與底物(疏水性與電荷性質)和溶劑(疏水性與極性)的理化性質有關[23-24]。本實驗結果表明，在2%的甲醇中，PG和COS-PG的Km和Vmax均下降。在2%的四氫呋喃中，PG和COS-PG的Km和Vmax均上升。說明2%的甲醇引起PG和COS-PG酶活力上升主要是通過酶對底物的親和力上升實現的，而2%的四氫呋喃引起PG和COS-PG酶活力上升主要是通過Vmax上升實現的。由此可以推斷，在2%的甲醇和四氫呋喃處理后，增加了酶分子的柔性，改變了酶催化中心的微環境，從而使底物更加容易進入酶的活性中心，并導致表觀的酶活性提高。在2%的乙醇處理后，PG和COS-PG的Km和Vmax下降，表明2%的乙醇引起PG和COS-PG酶活力下降主要是通過最大反應速率下降實現的，并且其反應機制類似于反競爭性抑制。在2%的丙酮處理后，PG和COS-PG的Km上升，而Vmax下降，表明2%的丙酮引起PG和COS-PG酶活力下降主要是通過酶對底物親和力下降和最大反應速率下降共同作用實現的，并且其反應機制類似于混合競爭性機制。

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Effect of Organic Solvent on Catalytic Kinetics of Polygalacturonase

LIU Xiao-lin1,2，LI Xiao-ting1，GONG Guo-yong1，HUANG Lei3，HUANG Zhuo-lie2，WU Zhi-quan2，LI Chun-yi2
(1. College of Life Sciences, Yichun University, Yichun 336000, China；2. College of Life Sciences, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China；3. Yichun Middle School, Yichun 336000, China)

Water-soluble chitosan with low molecular weight was employed to modify polygalacturonase (PG). After modification, the catalytic kinetics of PG and modified polygalacturonase (COS-PG) were investigated in buffer, methanol, ethanol, acetone and tetrahydrofuran solution using pectin as substrate. The results indicated thatKm of COS-PG revealed a slight decline, butVmax revealed an increase.Km andVmax of PG and COS-PG declined both in 2% methanol and 2% ethanol.Km andVmax of PG and COS-PG increased in 2% tetrahydrofuran solution. Conversely, in 2% acetone solution,Km increased butVmax declined.

polygalacturonase；organic solvents；dynamics

Q643.132

A

1002-6630(2012)05-0134-04

2011-04-14

劉小林(1966—)，男，副教授，博士，研究方向為生物化學與分子生物學。E-mail：LXL7519@yahoo.com.cn