海藻酸鈉固定靈芝細胞對胞外三萜類產量的影響

董玉瑋，湯步偉，苗敬芝，曹澤虹

(徐州工程學院食品(生物)工程學院，江蘇 徐州 221008)

海藻酸鈉固定靈芝細胞對胞外三萜類產量的影響

董玉瑋，湯步偉，苗敬芝，曹澤虹

(徐州工程學院食品(生物)工程學院，江蘇 徐州 221008)

采用海藻酸鈉和氯化鈣對靈芝細胞進行固定，研究包埋法固定靈芝細胞的工藝條件，探討固定化工藝對靈芝胞外三萜類產量的影響。結果表明：固定靈芝細胞的最佳工藝條件為：4.5%海藻酸鈉、2.2% CaCl2、培養基pH值自然，接種40個固定化小球，28℃、110r/min培養12d，胞外三萜類產量為(49.53±1.37)×10-2mg/mL。固定化靈芝細胞較未固定細胞，具有更好的耐酸、耐堿性，長時間培養仍具有較高的產三萜類能力，回收利用次數可達5次。

靈芝；三萜類；固定化；海藻酸鈉；氯化鈣

被譽為“四大菌王”、“九大仙草”之一的靈芝(Ganoderma lucidum)，作為藥食兼用的瑰寶，近年來，隨著靈芝子實體的栽培和菌體生物發酵的生產，使得靈芝在中藥、保健品、功能性食品上的應用更為普遍[1]。三萜類作為靈芝保肝、抗腫瘤的重要活性物質[2-3]，目前已分離到100多種，其產量已成為鑒定靈芝品種優劣的重要指標之一[4]。傳統靈芝栽培工藝受季節和原材料的限制，子實體產量低，不能滿足需要；單一的液體發酵技術雖然可以在一定程度上提高靈芝活性物質產量，但也存在投入成本高、產量不穩定等不足。固定化細胞技術是液體發酵技術與固定化酶技術的有機結合，是利用物理或化學手段將游離細胞定位于限定的空間區域并使其保持活性可以反復使用的一種技術，較液體發酵技術，可以提高微生物的催化活性，縮短生產周期，降低成本，增加產量，因而工業化生產前景廣闊[5-7]。固定化真菌細胞技術已取得一些研究成果，凸顯出很多優勢[8-9]，但該項技術在靈芝上的應用還極少。本實驗探討固定化靈芝細胞的工藝條件，及其對三萜類產量的影響，為合理開發靈芝資源，提高靈芝三萜類產量提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料、培養基與試劑

赤靈芝003為徐州工程學院微生物學實驗室保存的高產三萜類菌株；馬鈴薯 市售。

PDA斜面培養基：按照GB 4789.15—2010《食品衛生微生物學檢驗 霉菌和酵母計數》配制，用于菌種的復蘇及保存；可溶性淀粉培養基：可溶性淀粉3%、酵母膏1%、葡萄糖1.2%、KH2PO40.3%、MgSO4·7H2O 0.15%；再生培養基：蛋白胨0.1%、牛肉膏0.5%、葡萄糖2%、MgSO4·7H2O 0.5%、KH2PO40.046%、K2HPO40.1%、瓊脂2%、VB2和VB6少量[10]。

齊墩果酸標準品 昆明科翔生物科技有限公司；所用其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 菌種培養

取一小塊菌種接種于斜面培養基上，28℃培養144h，活化1次。接種活化后的菌塊于可溶性淀粉培養基中，250mL搖瓶80mL裝液量，28℃、110r/min搖床培養5 d。

1.2.2 靈芝細胞的固定化

選取長勢較好的靈芝菌絲，放入玻璃珠打散細胞后，加入一定質量分數的海藻酸鈉溶液(V靈芝菌液:V海藻酸鈉溶液＝1:3)，充分混勻后，用7號針頭吸取混合液滴入一定質量分數的CaCl2溶液中，形成固定化小球，直徑約2～3mm，放入4℃冰箱靜置2h，再放入28℃恒溫箱2h固定完全。取出后用甘露醇溶液沖洗2次，濾紙吸干后放入可溶性淀粉培養基，250mL搖瓶80mL裝液量，28℃、110r/min搖床培養一定時間[11]。

1.2.3 靈芝胞外三萜類產量的測定

1.2.3.1 胞外三萜類的提取

正丁醇中加蒸餾水于分液漏斗中充分混勻，靜置過夜，上層即為水飽和正丁醇。取發酵液15mL，用3倍體積的水飽和正丁醇萃取3次，合并正丁醇提取液，減壓蒸干，加4mL 95%乙醇溶解，備用[12]。

1.2.3.2 標準曲線的制作

精確稱取10mg齊墩果酸，置于50mL的容量瓶中，加甲醇定容至刻度。取試管6支，分別加入齊墩果酸溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，用甲醇補至1mL，加5%香草醛溶液(香草醛5g，加入冰醋酸100mL溶解)2mL，高氯酸5mL，混勻后60℃水浴20min，置涼水中15min，各加冰醋酸5mL，于波長550nm處測吸光度，繪制標準曲線。

1.2.3.3 比色法測定三萜類產量

分別取待測樣品溶液1mL于試管中(設3個重復)，加5%香草醛溶液2mL、高氯酸5mL混勻后，60℃水浴20min，置涼水中15min，加冰醋酸5mL，于波長550nm處測定吸光度[12]。根據標準曲線計算靈芝胞外三萜類產量。

2 結果與分析

2.1 不同質量分數海藻酸鈉對胞外三萜類產量的影響

分別取3.0%、3.5%、4.0%、4.5%、5.0%、5.5%的海藻酸鈉溶液，2.1%氯化鈣，pH值自然，制備固定化細胞小球。接種50個固定化小球于可溶性淀粉培養基，28℃培養11d，測定胞外三萜類產量，重復3次，結果見圖1。

圖1 海藻酸鈉質量分數對靈芝細胞胞外三萜類產量的影響Fig.1 Effect of sodium alginate concentration on extracellular triterpene yield

從圖1可以看出，隨著海藻酸鈉質量分數的增大，胞外三萜類產量先增大后減小。當海藻酸鈉質量分數小于4.5%時，固定化小球較易破裂，被固定化的靈芝菌絲新陳代謝較快，容易衰老，因此三萜類產量較少。當海藻酸鈉質量分數大于4.5%時，固定化小球阻礙了細胞對營養物質的吸收，三萜類產量也較低。當海藻酸鈉質量分數為4.5%時，胞外三萜類產量最高，為47.20×10-2mg/mL。

2.2 不同質量分數氯化鈣對胞外三萜類產量的影響

分別取1.8%、2.0%、2.2%、2.4%、2.6%的氯化鈣溶液，4.5%的海藻酸鈉溶液，pH值自然，制備固定化細胞小球。接種50個固定化小球于可溶性淀粉培養基，28℃培養11d，測定胞外三萜類的產量，重復3次，結果見圖2。

圖2 氯化鈣質量分數對靈芝細胞胞外三萜類產量的影響Fig.2 Effect of calcium chloride concentration on extracellular triterpenoid yield

從圖2可以看出，隨著氯化鈣質量分數增大，胞外三萜類產量先增大后減小。當氯化鈣質量分數小于2.2%時，海藻酸鈣外壁較薄，菌絲新陳代謝較快，易衰老，胞外三萜類產量較少。當氯化鈣質量分數大于2.2%時，海藻酸鈣外壁較厚，不利于營養物質的傳遞，胞外三萜類產量較少。當氯化鈣質量分數為2.2%時，胞外三萜類產量最高，為48.48×10-2mg/mL。

2.3 培養時間對未固定化、固定化靈芝細胞胞外三萜類產量的影響

采用4.5%海藻酸鈉和2.2%氯化鈣對靈芝細胞進行固定化，pH值自然，接種50個固定化小球于可溶性淀粉培養基，28℃培養，分別測定未固定化、固定化靈芝細胞4～16d時胞外三萜類產量，重復3次，結果見圖3。

圖3 培養時間對固定化前后靈芝細胞胞外三萜類產量的影響Fig.3 Effect of culture time on extracellular triterpenoid yield of nonimmobilized and immobilized Ganoderma lucidum

從圖3可以看出，隨著培養時間的延長，固定化、未固定化靈芝細胞胞外三萜類產量都先增大后減小，分別在第12、9天，三萜類產量達到最大值，分別為48.13×10-2mg/mL 和30.26×10-2mg/mL。固定化靈芝細胞培養前期(4～8d)，細胞生長較慢，海藻酸鈣白色鈣化外壁明顯，三萜類產量較少，且低于未固定化細胞，這是由于固定化工藝會在一定程度上損傷細胞，影響其生長，細胞需要一定時間適應固定化后的環境；培養中期(9～13d)，海藻酸鈣白色鈣化外壁透明度、光澤度增加，固定化小球直徑增大，表明靈芝細胞已經適應固定后的生長環境，活性增加，三萜類產量增加明顯，高于未固定化細胞；培養后期(14～16d)，海藻酸鈣外壁更加通透、稀薄，細胞老化程度加劇，形成的三萜類物質也逐漸被細胞作為營養物質重新吸收利用，培養液黏稠度增加，生長環境質量下降，三萜類產量逐漸降低，但仍高于未固定化細胞。

2.4 pH值對未固定化、固定化靈芝細胞胞外三萜類產量的影響

分別調節培養基pH值為1.5～12.5，采用4.5%海藻酸鈉和2.2%氯化鈣對靈芝細胞進行固定化，接種50個固定化小球于可溶性淀粉培養基，28℃培養12d，未固定化細胞28℃培養9d，分別測定未固定化、固定化靈芝細胞胞外三萜類產量，重復3次，結果見圖4。

圖4 pH值對固定化前后靈芝細胞胞外三萜類產量的影響Fig.4 Effect of culture pH on extracellular triterpenoid yield of nonimmobilized and immobilized Ganoderma lucidum

從圖4可以看出，隨著pH值增加，未固定化、固定化靈芝細胞胞外三萜類產量都先增大后減小，都在pH5.5(培養基自然pH值)時，達到最高，分別為30.26×10-2mg/mL 和49.17×10-2mg/mL。強酸、強堿性條件對靈芝細胞生長均有抑制作用，固定化后在一定程度上可以保護細胞，因此相同pH值條件下，固定化后靈芝細胞胞外三萜類產量都高于未固定化細胞，表現出較好的耐酸、耐堿性。但是當pH值大于6.5后，由于氫離子減少，古羅糖醛酸與甘露糖醛酸不足以形成分子間橋聯[13]，所以堿性條件對固定化細胞影響較大，三萜類產量減少明顯。

2.5 回收次數對固定化靈芝細胞胞外三萜類產量的影響采用4.5%海藻酸鈉，2.2% CaCl2，pH值自然，接種50個固定化小球于可溶性淀粉培養基，每次28℃培養

12d，取出固定化小球，加入新鮮培養基繼續培養，測定每次發酵液胞外三萜類產量，重復3次，結果見圖5。

圖5 回收次數對固定化靈芝細胞胞外三萜類產量的影響Fig.5 Effect of repeated use on extracellular triterpenoid yield of immobilized Ganoderma lucidum

從圖5可以看出，回收5次后，固定化靈芝細胞仍然具有一定的產胞外三萜類的能力，可回收性能良好。隨著回收次數增加，不斷有固定化小球發生破裂，尤其是回收3次以后，破裂數明顯增多，同時小球體積增大，第5次回收后，小球直徑均在1.5～2.5cm，海藻酸鈣膨脹能力已近極限，因此第6次回收后，剩余固定化小球在培養過程中均破裂，但游離細胞仍具有產胞外三萜類的能力，因此仍可測出胞外三萜類產量。2.6 接種量對固定化靈芝細胞胞外三萜類產量的影響

采用4.5%海藻酸鈉，2.2%氯化鈣固定靈芝細胞，pH值自然，分別接種10、20、30、40、50、60、70個固定化小球，28℃培養12d，測定胞外三萜類的產量，重復3次，結果見圖6。

圖6 接種量對固定化靈芝細胞胞外三萜類產量的影響Fig.6 Effect of inoculum size on extracellular triterpenoids yield of immobilized Ganoderma lucidum

從圖6可以看出，隨著接種量的增加，胞外三萜類產量先增大后減小，接種量較低時，菌絲生長速度慢，接種量高則會相互競爭營養，氧氣急劇消耗，造成生長過剩，不利于胞外三萜類的積累，當接種40個固定化小球時，胞外三萜類產量達到最高，為47.01×10-2mg/mL。2.7 固定化靈芝細胞最佳條件

圖7 最佳固定化工藝條件下的靈芝菌球形態Fig.7 Mycelium pellets of Ganoderma lucidum immobilized under optimum conditions

根據海藻酸鈉固定化靈芝細胞的最佳工藝條件：4.5%海藻酸鈉，2.2% CaCl2，pH值自然，接種40個固定化小球，28℃、250mL搖瓶80mL裝液量，110r/min培養12d，重復3次，胞外三萜類產量為(49.53±1.37)×10-2mg/mL，固定化靈芝菌球形態見圖7。固定化小球平均半徑約為3～4mm，大小均一，透明度、光澤度較好。由于固定化工藝能夠形成高度密集而體積小的生產菌集合體，同時細胞膜、細胞壁和海藻酸鈣載體都存在著擴散限制作用，有利于集中、高效的利用營養物質，因此固定化后細胞生長、增殖能力提高，抗逆性增強，老化速度降低，細胞壽命延長，穩定性增加，可長時間反復使用。

3 結 論

海藻酸鈉固定靈芝細胞最佳工藝條件為：4.5%海藻酸鈉，2.2% CaCl2，pH值自然，接種40個固定化小球，28℃、250mL搖瓶80mL裝液量，110r/min培養12d，胞外三萜類產量為49.53×10-2mg/mL。固定化靈芝細胞較未固定細胞具有更好的耐酸、耐堿性，長時間培養仍具有較高的產胞外三萜類能力，回收利用次數可達5次。

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Immobilization of Ganoderma lucidum in Sodium Alginate Beads and Effect on Extracellular Triterpene Production

DONG Yu-wei，TANG Bu-wei，MIAO Jing-zhi，CAO Ze-hong
(College of Food (Biological) Engineering, Xuzhou Institute of Technology, Xuzhou 221008, China)

In this study, Ganoderma lucidum were immobilized by sodium alginate and calcium chloride. Immobilization conditions of Ganoderma lucidum using entrapment method were studied. The effects of immobilization conditions on triterpenes yield were also evaluated. The results showed the optimal conditions of immobilization of Ganoderma lucidum by sodium alginate were as follows: 4.5% of sodium alginate, 2.2% of calcium chloride, nature pH, 40 immobilized beads, 28 ℃, 110 r/min, cultured 12 days, the highest triterpenes yield was (49.53±1.37)×10-2mg/mL. Immobilized cells had better acid and alkali resistance,higher triterpenes yield after long time culture than non-immobilized cell. It can be recycled five times.

Ganoderma lucidum；triterpenoids；immobilization；sodium alginate；calcium chloride

TS201.3

A

1002-6630(2012)05-0234-04

2011-04-11

江蘇省高校自然科學研究項目(09KJD180008)；徐州工程學院校級科研項目(XKY2008228)

董玉瑋(1980—)，男，講師，碩士，研究方向為食品生物技術。E-mail：dongyuwei66@163.com