一種薏苡抗真菌蛋白的制備及抑菌活性研究

李 晨，白承之，李玉英，王轉花*

(化學生物學與分子工程教育部重點實驗室，山西大學生物技術研究所，山西 太原 030006)

一種薏苡抗真菌蛋白的制備及抑菌活性研究

李 晨，白承之，李玉英，王轉花*

(化學生物學與分子工程教育部重點實驗室，山西大學生物技術研究所，山西 太原 030006)

以薏苡(Coix chinensis)種子為實驗材料，通過脫脂、水提、Resource S陽離子交換層析和Superdex 75凝膠排阻層析等步驟純化得到一種新的抗真菌蛋白，并對其抑菌活性進行初步鑒定。SDS-PAGE分析顯示該蛋白的分子質量約為28kD。抑菌活性鑒定表明，該蛋白對鏈格孢霉(Alternaria alternate)、綠色木霉(Trichoderma reesei)和白腐菌(Panus conchatus) 3株絲狀真菌具有顯著的生長抑制活性，并呈現出劑量依賴的特征。本研究建立分離薏苡28kD抗真菌蛋白的方法，制備方法簡單易行，所得產品純度達到95%以上。

薏苡種子；抗真菌蛋白；純化

植物種子中普遍含有一種或幾種抗真菌蛋白(antifungal proteins，AFPs)，這類蛋白賦予植物種子或植株抵抗真菌侵蝕的能力。天然植物AFPs具有來源廣泛，抗菌譜廣，無污染等特點，成為研究的熱點之一。隨著研究的深入，發現有些AFPs還可以抑制HIV-1反轉錄酶[1-3]。近年來，陸續有多種植物來源的AFPs被純化和鑒定[4]，這些蛋白的分子質量大小不同，從幾千到60kD不等。2005年，巴西科學家在高粱種子中純化并鑒定了一種分子量為30kD的抗真菌蛋白[5]。國內學者先后從花生[6]、黑豆[7]、紅扁豆[8]中純化得到抗真菌蛋白并對它們的抑菌活性進行了鑒定。

薏苡為禾本科一年生或多年生草本植物，去除外殼和種皮的種仁可入藥，《本草綱目》中提及薏苡種子“健脾益胃、補肺清熱、祛風勝溫、強筋骨”。薏苡種子富含脂肪、多種氨基酸、大量的VB1、VB2以及鈣、磷、鎂、鉀等生物活性成分，是非常有價值的藥食同源食品[9]。薏苡在我國大部分地區均有種植，國家對薏苡種子的開發利用也很重視。最近，研究者從薏苡麩皮中提取出幾種可以抑制乳腺癌細胞的小分子活性物質[10]。2008年，劉靜等[11]以薏苡蛋白為實驗材料篩選其中的抗菌成分，獲得一種分子質量約38kD的抗真菌蛋白。一種植物中可能含有多種AFPs[12]，有關薏苡中新的抗菌蛋白及其詳細的抑菌活性有待深入研究。本實驗以薏苡種子為材料提取其總蛋白，通過兩步層析分離，純化得到一種抗真菌蛋白，并對該蛋白的分子質量和抑菌活性進行研究，為深入開展制備植物種子來源的抗真菌蛋白提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 菌種、材料與儀器

鏈格孢霉(Alternaria a lternata)、白腐菌(Panus conchatus)、綠色木霉(Trichoderma reesei)由山西大學生命科學學院提供；實驗所用試劑均為分析純。

薏苡種子購自當地市場。

Resource S離子交換層析柱、Superdex 75 10/300 GL層析柱 美國GE Healthcare公司。

1.2 方法

1.2.1 薏苡種子抗真菌蛋白的純化

薏苡種子經過低溫干燥后粉碎，過0.2mm孔徑篩網，以3:1(V/m)的比例加入丙酮，4℃攪拌脫脂3h后減壓抽濾，向所得濾餅中加入乙醚，低溫攪拌3h，減壓抽濾，濾餅低溫干燥后即為薏苡種子脫脂粉。取薏苡種子脫脂粉20g，加入200m L浸提緩沖液(20mmol/L Tris-HCl，pH 8.0)，4℃攪拌浸提6h，12000×g離心，取上清，加入硫酸銨至80%飽和度，攪拌提取6h，12000×g離心，沉淀用少量浸提緩沖液溶解后透析，所得蛋白溶液為薏苡種子水溶性總蛋白。

將上述水溶性總蛋白用平衡緩沖液充分透析平衡后，上樣于Resource S陽離子交換柱進行分離。平衡緩沖液為20mm ol/L NH4OAc，pH 4.5，洗脫緩沖液為20mmol NH4OAc，1mol/L、pH 4.5的NaCl溶液，控制流速為0.5m L/m in，用0.1、0.2、1mol/L的NaC l洗脫緩沖液進行不連續梯度洗脫，收集各洗脫峰，并進行抗真菌活性的分析。

將具有抑菌活性的洗脫組分上樣于Superdex 75 10/300 GL凝膠層析柱進一步分離，緩沖液為20mmol/L Tris-HCl，內含150mmol/L NaCl，pH 8.0，控制流速為0.5m L/m in。收集各洗脫峰，進行抗真菌活性的篩選。

1.2.2 SDS-PAGE測定分子質量

采用SDS-PAGE法[13]測定，以標準分子質量蛋白為對照，4%濃縮膠，12.5%分離膠。

1.2.3 真菌生長抑制活性測定

采用牛津杯法[14]測定各層析組分的真菌生長抑制活性，受檢真菌為鏈格孢霉(Alternaria alternate)、綠色木霉(Trichoderma reesei)和白腐菌(Panus conchatus)。將供試菌株點植于PDA培養基中心，于28℃培養至菌落直徑達到1～2cm，在距離菌落邊緣1cm處放置滅菌的牛津杯，各取200μL樣品組(含目的蛋白)和對照組(不含目的蛋白，其他條件完全相同的緩沖液)，用0.22μm微孔濾膜過濾除菌后加入牛津杯內，4℃預擴散24h，28℃繼續培養72h，觀察菌落生長狀況。

2 結果與分析

2.1 薏苡種子抗真菌蛋白的純化結果

薏苡種子水溶性總蛋白經Resource S陽離子交換柱分離，得到6個蛋白洗脫峰(圖1)。經檢測，峰Ⅲ具有抗真菌活性，將峰Ⅲ上樣于Superdex 75 10/300 GL層析柱進一步分離，得到兩個洗脫峰(圖2)，經測定，峰Ⅰ具有抗真菌活性。

圖1 薏苡種子抗真菌蛋白的Resource S陽離子交換層析Fig.1 Cation exchange Resource S cation exchange column chrom atography for the protein from ad lay seeds

圖2 陽離子交換層析活性洗脫峰Ⅲ的Superdex 75凝膠排阻層析Fig.2 Size exclusion chromatographic of fraction III obtained in Resource S cation exchange column fraction on Superdex Pep tide HR 10/300 column

2.2 抗真菌蛋白分子質量測定

圖3 薏苡種子抗真菌蛋白的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE of purified antifungal p rotein from ad lay seeds

采用SDS-PAGE法測定薏苡種子抗真菌蛋白的分子質量，以標準蛋白的相對遷移率和分子質量的對數做標準曲線，根據目的蛋白的相對遷移率，得出其分子質量約為28kD。電泳結果(圖3)顯示，與薏苡種子水溶性總蛋白(泳道1)相比，目的蛋白(泳道2)得到了高度純化，其表觀純度大于95%。

2.3 真菌生長抑制活性檢測

圖4 薏苡種子抗真菌蛋白對3株真菌生長抑制的劑量依賴性實驗Fig.4 Effect of P antifungal protein aging

由圖4可知，目的蛋白可明顯抑制供試霉菌的生長。由于抗真菌蛋白的抑制作用，兩株主要依靠菌絲延伸增殖的霉菌，鏈格孢霉和白腐菌(圖4A、C)，在菌落邊緣形成類似弦月的抑制形態(圖4A-1和圖4C-2)。綠色木霉(圖4B)依靠孢子增殖，菌絲可以繞過抗真菌蛋白的抑制區繼續擴散，抑制區的菌落形成了一個類似抑菌圈的抑制形態(圖4B)，隨著用樣量的增大，呈現出明顯的劑量依賴效應，而在相同條件下，對照組(圖4B-0)菌絲擴散沒有受到影響，菌落邊緣呈現規則的圓形。

3 結 論

本實驗通過Resource S陽離子交換層析和Superdex 75凝膠排阻層析，從薏苡種子中純化出一種可以抑制鏈格孢霉(Alternaria a lternate)、綠色木霉(Trichoderma reesei)和白腐菌(Panus conchatus)生長的抗真菌蛋白。

目前，由于抗生素的大量使用，耐藥菌株和多重耐藥菌株不斷增加，使抗感染治療成為難題。隨著社會的進步，多種添加劑因為不符合新的安全要求而被停止使用。植物種子來源的抗真菌蛋白因來源廣泛，抗菌譜廣，不易產生抗藥性，無毒副作用[15]等特點，在新型藥物開發、食品添加劑、化妝品和保健食品等方面有廣闊的開發前景[16]。本實驗以薏苡種子為研究對象，獲得了一種新的薏苡28kD抗真菌蛋白，對3株常見的農業致病真菌有顯著的生長抑制作用。該蛋白的結構特征以及是否具有抗腫瘤作用正在進一步研究中。本研究建立的薏苡抗真菌蛋白提取技術簡單，目的蛋白純度較高，為進一步研究其抗病機理及植物原添加劑應用于農作物保護和食品工業領域奠定基礎。

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Isolation and Antifungal Properties of a New Protein from Adlay Seeds (Coix chinensis)

LI Chen，BAI Cheng-zhi，LI Yu-ying，WANG Zhuan-hua*
(Key Laboratory of Chemical Biology and Molecular Engineering, Ministry Education, Institute of Biotechnology, Shanxi University, Taiyuan 030006, China)

A protein from adlay (Coix chinensis) seeds was isolated by degrease with acetone and ether, extraction with 20 mmol/L Tris-HCl buffer, ion exchange chromatography on Resource S column and size exclusion chromatography on Superdex 75 column. The purity was higher than 95%. Partial characterization and antifungal activity were assayed. The protein exhibited a molecule mass of 28 kD in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. This protein could exert potent inhibitory activity toward fungal species includingAlternaria alternate,Trichoderma reeseiandPanus conchatusin a dose-dependent pattern. Antifungal protein has become a popular research topic because of their resistance to pathogenic diseases. In this paper, the studies have demonstrated that adlay seeds have potentially exploitable significance and explored an effective method for the isolation and purification of antifungal proteins from plant seeds.

adlay seeds；antifungal protein；purification

Q516

A

1002-6630(2012)05-0046-03

2011-08-17

國家自然科學基金面上項目(30970611；31171659)；山西省科技攻關計劃項目(20100321101)

李晨(1981—)，女，博士研究生，研究方向為生物活性物質。E-mail：lichen@sxu.edu.cn

*通信作者：王轉花(1956—)，女，教授，博士，研究方向為植物基因工程與蛋白質工程。E-mail：zhwang@sxu.edu.cn