水酶法提取大豆油脂過程中蛋白相對分子質量變化對油脂釋放的影響

隋曉楠，江連洲,*，李 楊，齊寶坤，劉 雯

(1.東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.國家大豆工程技術研究中心，黑龍江 哈爾濱 150030)

水酶法提取大豆油脂過程中蛋白相對分子質量變化對油脂釋放的影響

隋曉楠1,2，江連洲1,2,*，李 楊1,2，齊寶坤1,2，劉 雯1,2

(1.東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.國家大豆工程技術研究中心，黑龍江 哈爾濱 150030)

分析對比4種擠壓膨化工藝和4種蛋白酶對水酶法水解擠壓膨化大豆的油得率、蛋白得率的影響，并分析水解過程中蛋白相對分子質量的變化與油脂釋放的關系。結果表明，Alcalase 2.4L堿性蛋白酶水解膨化大豆粉3.6h后油脂已經被充分釋放出來。水解過程中油脂釋放率與蛋白性質變化的分析表明，油脂釋放的狀態與相對分子質量大于70000的蛋白質能否被水解到相對分子質量小于5000的肽有一定的聯系。水解3.5h后近90%易水解的大分子蛋白被水解為相對分子質量小于5000的肽，此時油脂已經充分釋放。水解前油脂受到相對分子質量大于70000的蛋白的束縛，油脂釋放不夠完全。

擠壓膨化；水酶法；蛋白相對分子質量；油脂釋放

近些年來，由于正己烷的危害逐步被大家認識到，因此尋求一種健康的綠色提油方法的需求日益增大[1]。將擠壓膨化與水酶法提取技術相結合利用從低含油的大豆中提取油脂，成為了一種替代正己烷提取油脂的綠色方法[2]。擠壓膨化工藝使大豆細胞壁受到破壞，更有利于油脂釋放；在高溫、高壓、高剪切力作用下使蛋白質的分子結構發生伸展、重組，分子表面的電荷重新分布，分子間氫鍵、二硫鍵部分斷裂，導致蛋白質變性，蛋白質的消化率明顯提高，通過蛋白增加表面積和蛋白變性從而更有利于酶對大豆蛋白質的作用[1-5]。擠壓可增加蛋白對酶攻擊的敏感性[6-7]，使得在酶解后油脂釋放更充分，并且減少酶解全脂豆粉后油與蛋白形成乳狀物[8-9]。然而目前國外研究均在特定的擠壓膨化參數條件下進行預處理后采用水酶法提取大豆油脂和蛋白[10-14]，并未優化適合水酶法同時提取大豆油脂和蛋白的擠壓膨化工藝參數與擠壓膨化后的酶水解工藝參數，且對相關的機理研究較少。本實驗針對此類問題，在通過確定適合水酶法提取的蛋白酶和酶解工藝參數的基礎上，探討大豆蛋白質水解過程中相對分子質量的變化與油脂釋放的關系。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆(農墾42號)由黑龍江省農業科學院提供，其水分含量10.6%、蛋白含量41.6%、油脂含量20.8%、灰分含量4.3% (以干物質計)。

2.4L堿性蛋白酶(2.4AU/g)、復合蛋白酶(1.5AU/g)丹麥Novo-Nodisk公司；Protex 7L中性蛋白酶(13.5AU/g)、Protex 50FP風味蛋白酶(13.5AU/g) 美國Genencor公司；木瓜蛋白酶(16～40AU/g)、蛋白標準品(牛白蛋白、蛋卵清蛋白、胰蛋白酶、溶菌酶和胰島素酶) 美國Sigma Aldrich公司。

1.2 儀器與設備

雙螺桿擠壓機(由螺桿、六節套筒以及加熱冷卻系統組成，配有喂料、溫度、壓力控制系統，套筒可沿徑向開合，方便物料的采集清理) 東北農業大學工程學院農產品加工實驗室；DMI3000 B倒置顯微鏡 德國Leica公司；AKTA 100蛋白純化儀 瑞典Amersham公司。

1.3 方法

1.3.1 擠壓膨化大豆蛋白水酶法提油工藝流程

1.3.2 不同預處理步驟

干法擠壓膨化的步驟為：1)大豆去殼；2)破碎大豆籽粒；3)壓片，大豆片厚度為5mm；4)擠壓膨化。濕法擠壓膨化的步驟為：1)大豆去殼；2)破碎大豆籽粒；3)壓片，大豆片厚度為5mm；4)調節物料含水率為14.5%；5)擠壓膨化。濕熱處理的步驟為：1)大豆去殼；2)破碎大豆籽粒；3)壓片，大豆片厚度為5mm；4)用100℃水蒸氣處理30min。超聲波處理的步驟為：1)大豆去殼；2)粉碎大豆籽粒(粉碎后的顆粒度為0.48～1.6mm)；3)超聲波處理30min，300W，60℃。

1.3.3 擠壓膨化工藝參數

采用雙螺桿擠壓機完成擠壓膨化操作，具體參數為：模孔孔徑20mm，螺桿轉速105r/min，套筒溫度90℃[15-16]。原料經錘片式粉碎機過3mm篩板處理，膨化后的膨化料再利用中藥粉碎機粉碎30s作為水解原料。

1.3.4 4種酶酶法提取大豆油脂和蛋白能力的對比實驗

分別研究中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、風味蛋白酶、堿性蛋白酶以及復合蛋白酶的水酶法提取大豆油脂和蛋白的能力。在料液比為1:5，各種酶的建議pH值和酶解溫度條件下(2.4L堿性蛋白酶，pH7，50℃；復合蛋白酶，pH8，50℃；Protex 7L中性蛋白酶，pH9，60℃；Protex 50FP風味蛋白酶，pH7，50℃；木瓜蛋白酶，pH4，40℃)，考察不同加酶量和酶解時間對總油提取率與總蛋白提取率的影響。通過對最優加酶量和酶解時間條件下總油提取率與總蛋白提取率的對比，確定適合大豆水酶法提取油脂和蛋白的最佳蛋白酶。

1.3.5 蛋白水解過程中相對分子質量變化與油脂釋放關系

1.3.5.1 蛋白質標準品的Sephadex G-75凝膠洗脫

將已知相對分子質量的標準品：牛血清白蛋白(相對分子質量66000)、卵白蛋白(相對分子質量44000)、胰蛋白酶(相對分子質量21000)、溶菌酶(相對分子質量14000)和胰島素(相對分子質量5500)分別稱取20mg，溶解于3mL pH8的磷酸鹽緩沖溶液中。將5種配制好的蛋白質標準品溶液混合振蕩均勻后，抽取混合液1mL加樣到Sephadex G-75柱，在波長280nm處分別檢測蛋白質吸光度。采用最小二乘法，根據標準品相對分子質量對數與保留時間的關系建立線性回歸方程。

1.3.5.2 膨化大豆2.4L堿性蛋白酶水解產物Sephadex G-75凝膠洗脫

在擠壓膨化工藝(模孔孔徑20mm，物料含水率14.5%，螺桿轉速105r/min，套筒溫度90℃)和酶解工藝(加酶量1.85%，酶解溫度50℃，酶解時間3.6h，料水比1:6，酶解pH9.26)條件下，按照不同水解時間取樣品噴霧干燥。分別稱取噴霧干燥后粉末20mg溶解于3mL、pH8的磷酸鹽緩沖溶液中。將待測樣品混合振蕩均勻后，抽取1mL經0.22μm微濾膜過濾后加樣到Sephadex G-75柱，在波長280nm處分別檢測蛋白質吸光度。

1.3.6 指標計算方法

大豆物料以及殘渣含油質量分數的測定：參考AOAC 922.06法；大豆物料以及殘渣含蛋白質量分數含量的測定：參考AOAC 993.13法。按式(1)計算游離油提取率，按式(2)計算蛋白提取率。

式中：m為游離油質量；m1為大豆物料的質量；w為大豆含油質量分數；m2為殘渣的質量；w1為大豆含蛋白質量分數；w2為殘渣含蛋白質量分數。

2 結果與分析

2.1 預處理方法的對比分析

對比研究干法擠壓膨化、濕法擠壓膨化、濕熱處理、超聲波處理大豆蛋白后得到的游離油提取率、蛋白提取率，確定最適合水酶法提取大豆油脂和蛋白的預處理方法。

圖1 不同預處理方法對游離油和蛋白提取率的影響Fig.1 Comparison of different pretreatment methods on the yield of total oil and protein

由圖1可見，干法擠壓膨化預處理與濕法擠壓膨化預處理較其他預處理方法有較大優勢。由于濕法擠壓膨化預處理需蒸汽加熱，其溫度高、能耗大且蛋白變性嚴重，因此本實驗確定最適合水酶法提取大豆油脂和蛋白的預處理方法為干法擠壓膨化預處理方法。

2.2 水解蛋白酶種類對大豆油脂和蛋白提取率影響的對比分析

圖2 中性、風味、堿性、復合以及木瓜蛋白酶對游離油和蛋白提取率的影響Fig.2 Effects of Protex 7L, Protex 50FP, Alcalase 2.4L, Protamex and Papain on the yield of oil and protein

由圖2可見，利用堿性蛋白酶進行水酶法提取，游離油提取率、蛋白提取率均高于其他4種酶的水解效果。以下實驗利用水酶法提取大豆油脂和蛋白工藝中均選用2.4L堿性蛋白酶。酶解工藝參數為：加酶量1.85%、酶解溫度50℃、酶解時間3.6h、料水比1:6、酶解pH值 9.26。

2.3 水酶法提取過程中蛋白水解與油脂釋放的關系

水解過程中利用考馬斯亮藍對蛋白質染色，蘇丹紅Ⅲ對脂肪球染色[17]，結果見圖3。

圖3 大豆蛋白水解過程中油脂釋放狀態顯微切片觀察結果Fig.3 The release of oil during the hydrolysis of protein

由圖3可知，未水解前體系中并無明顯可見油滴存在。水解1h時，由于水解時間較短，一部分脂肪已經游離出來。水解超2h時油脂釋放量增大且脂肪球聚集，但聚集后的脂肪球粒徑較小。水解3h時小粒徑脂肪球逐漸聚集為大粒徑脂肪球，此時染色的蛋白質已經從背景中消失，說明蛋白質已經逐步被酶解為不能被染色的肽類物質。水解時間超過3.6h繼續水解油滴顆粒大小已經不再變化。由此可知，擠壓膨化后水酶法提取大豆油脂過程中，蛋白質的水解狀態對油脂釋放起到重要影響。通過對圖3的觀察發現，在最優水解條件下2.4L堿性蛋白酶水解干法膨化大豆3.6h后油脂釋放較充分。

2.4 蛋白質水解過程中相對分子質量變化與油脂釋放關系探討

通過研究發現干法擠壓膨化后水酶法提取大豆油脂過程中，蛋白質的水解狀態對油脂釋放有一定影響。因此針對2.4L堿性蛋白酶水解膨化大豆過程中蛋白相對分子質量的變化進行研究，并分析蛋白相對分子質量變化與油脂釋放之間的關系。

圖4 蛋白質標準品的Sephadex G-75凝膠洗脫圖譜Fig.4 Elution profile of protein standard sample in Sephadex G-75 gel

蛋白質標準品的Sephadex G-75凝膠洗脫圖譜如圖4所示。相對分子質量對數與保留時間的回歸方程為：y＝－0.0821x＋6.4726(R2＝0.9883)，其中，x表示保留時間/min；y為lgMr。采用該回歸方程可以根據某蛋白的保留時間估算出該物質的相對分子質量。

膨化大豆2.4L堿性蛋白酶水解產物Sephadex G-75凝膠洗脫圖譜如圖5所示。

圖5 膨化大豆的2.4L堿性蛋白酶水解產物Sephadex G-75凝膠洗脫圖譜Fig.5 Elution profile of extruded soybean hydrolysates by Alcalase 2.4L in Sephadex G-75 gel

由圖5可知，各樣品洗脫譜圖存在兩個主峰，根據相對分子質量對數與保留時間關系的線性方程換算出各峰的相對分子質量發現，先出現的第一個主峰為相對分子質量大于70000的蛋白質，后出現的一系列峰為相對分子質量小于5000的肽，由此可知水解時間對樣品相對分子質量分布的影響規律，結果見表1。

表1 酶解時間與水解蛋白相對分子質量分布的關系Table 1 Correlation between the distribution of protein molecular weights and hydrolysis time

從表1可以看出，水解過程中大豆蛋白相對分子質量的變化經過從蛋白眎到蛋白胨，最后變成小肽。隨著時間的延長，樣品中相對分子質量小于5000肽的百分比逐漸增大，但在水解時間大于4h后略有波動，分析可能是由于水解4h后一部分未能通過0.22μm微濾膜的蛋白被水解，導致大于70000蛋白的百分比增加，而在水解4.5h后該部分蛋白進一步水解為肽。從圖5還可以看出，洗脫譜圖中始終存在相對分子質量大于70000蛋白的高峰，說明膨化大豆蛋白中始終存在一些不容易被水解的蛋白成分。

由表1和圖5與圖3蛋白水解過程中相對分子質量變化與油脂釋放狀態對比可知，水解3.5h后近90%易水解的大分子蛋白質被水解為相對分子質量小于5000的肽，而此時油脂已經充分釋放。由此推斷，水解前油脂受到相對分子質量大于70000蛋白質的束縛，油脂不能夠得到很好的釋放。

3 結 論

通過對干法擠壓膨化大豆水解過程的顯微切片觀察分析可知，擠壓膨化后水酶法提取過程中，蛋白質水解與油脂釋放同步進行，并且蛋白質的水解狀態對油脂釋放起到重要影響。2.4L堿性蛋白酶水解膨化大豆粉3.6h后油脂已經被充分釋放出來。水解過程中蛋白質沒有完全被水解為多肽時，油脂已經逐步從蛋白的束縛中被釋放出來。水解3.5h后近90%易水解的大分子蛋白質被水解為相對分子質量小于5000的肽，此時油脂已經充分釋放。經推斷，水解前油脂受到相對分子質量大于70000蛋白質的束縛，油脂不能夠得到很好的釋放。

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Effect of Molecular Weight Change on Oil Release during Enzyme-assisted Aqueous Extraction Process of Oil

SUI Xiao-nan1,2，JIANG Lian-zhou1,2,*，LI Yang1,2，QI Bao-kun1,2，LIU Wen1,2
(1. College of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China；2. National Research Center of Soybean Engineering and Technology, Harbin 150030, China)

In this study, the yields of oil and protein obtained from 4 extrusion methods and enzymatic hydrolysis of four enzymes were compared. Meanwhile, the relationship between protein molecular weight and oil yield during enzyme-assisted aqueous extraction process (EAEP) was also explored. By using Alcalase 2.4L, oil was almost completely released after 3.6 h. The release of oil had an obvious correlation with molecular weight of the protein hydrolyzed from 70000 to 5000. After 3.5 h hydrolysis, 90% protein was hydrolyzed into peptide with molecular weight smaller than 5000. Oil cannot be released at the beginning of EAEP, due to the inhibition of protein with molecular weight larger than 70000.

extrusion；aqueous enzymatic extraction process；protein molecular weight；oil release

TS214.2；TS225.13

A

1002-6630(2012)05-0037-05

2011-09-09

黑龍江省科技攻關計劃項目(GA09B401-6)

隋曉楠(1987—)，男，碩士研究生，研究方向為糧食油脂及植物蛋白工程。E-mail：xiaonan.sui@hotmail.com

*通信作者：江連洲(1960—)，男，教授，博士，研究方向為糧食油脂及植物蛋白工程。E-mail：jlzname@163.com