耐高溫α-淀粉酶高密度高表達發酵條件的優化

胡建恩，曹 茜,，楊 帆,，房耀維，王淑軍,*，呂明生，葛 亮，李 瑛

(1.大連海洋大學食品科學與工程學院，遼寧 大連 116023；2.淮海工學院海洋學院，江蘇 連云港 222005；3.上海海洋大學食品學院，上海 201306；4.江南大學生物工程學院，江蘇 無錫 214122)

耐高溫α-淀粉酶高密度高表達發酵條件的優化

胡建恩1，曹 茜1,2，楊 帆1,2，房耀維2，王淑軍2,*，呂明生2，葛 亮3，李 瑛4

(1.大連海洋大學食品科學與工程學院，遼寧 大連 116023；2.淮海工學院海洋學院，江蘇 連云港 222005；3.上海海洋大學食品學院，上海 201306；4.江南大學生物工程學院，江蘇 無錫 214122)

通過搖瓶實驗對產耐高溫α-淀粉酶的重組菌E. coliBL21的高密度高表達發酵條件進行研究。考察不同培養基和不同發酵條件對該菌株產耐高溫α-淀粉酶的影響，并利用正交試驗進行優化。結果表明：在葡萄糖0.5g/L，酵母粉15g/L，pH6.5，誘導時機為接種后發酵4h，誘導時間為6h，IPTG添加量為0.8mmol/L，接種量為體積分數3%的優化條件下，該重組菌發酵液菌體生物量為原來的1.29倍，酶活力達到8.754U/mL，是原來的1.55倍，目的蛋白的表達量也為原來的1.24倍。

耐高溫α-淀粉酶；大腸桿菌BL21；發酵培養基；發酵條件

α-淀粉酶作為淀粉酶的一種，是目前一類最重要、最古老、應用范圍最廣的工業酶制劑之一，其中耐高α-淀粉酶憑借其熱穩定上的優勢經占據很大的市場。用耐高溫α-酶代替普通α-淀粉酶起到推動新工藝新技術的運用與研究，降低消耗、降低成本的作用。近年來，我國耐高溫α-淀粉酶的產量和出口量逐年增長，但生產成本愈來愈高，利潤空間日漸趨小[1-3]。因此如何能以最低投入，實現單位發酵液的最高目的蛋白表達量，成為發酵工業生產中研究的重點。

本研究室從海底熱液口獲得了一株超嗜熱古菌Thermococcus siculiHJ21，該菌株分泌的耐高溫α-淀粉酶的最適作用溫度為95℃，在100℃仍有60%的酶活力，酶的最適作用pH5.0，在pH4.5仍有80%的酶活力，酶在90℃的半衰期為5h，在100℃ 作用2h仍有40%的殘余酶活力，酶的熱穩定性不依賴Ca2+，比較符合淀粉工業加工過程中所需要的條件。對超嗜熱古菌Thermococcus siculiHJ21α-淀粉酶基因進行了克隆、表達和定向進化研究，獲得了活性、熱穩定性提高的突變酶[4-7]。本研究中含有超嗜熱古菌HJ21α-淀粉酶基因的突變基因工程菌產生的耐高α-淀粉酶，不僅具有更高的作用溫度和更低的作用pH值，而且具有比其野生菌更好的熱穩定性。本研究以突變的大腸桿菌BL21工程菌為基礎，通過對其發酵培養基和發酵條件進行優化，以期提高其發酵液耐高溫α-淀粉酶酶活力，降低成本，為該酶工業化生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養基

含質粒pET28-amy的重組E.coli21，淮海工學院海洋微生物研究室保存。

LB培養基(g/L)：蛋白胨10、酵母粉5、NaC1 10、卡那霉素0.05，pH7.5，卡那霉素與異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)均由0.22μm微孔濾膜法過濾除菌，其他培養基成分均在121℃滅菌20min。

1.2 培養方法

種子液制備：將活化的菌種以體積分數1%接種量接入含有100mL LB培養基的250mL三角瓶中，37℃、180r/min搖瓶培養12h，作為種子液。

發酵培養：將種子液以1%接種量接入裝有100mL LB培養基的250mL三角瓶中，在37℃、180r/min條件下搖床培養，當培養菌液OD600nm達到0.5(約4h)時，再加入誘導劑IPTG(終濃度為1mmol/L)，誘導4h。測菌液OD600nm，酶活力及目的蛋白表達量。

1.3 發酵培養基的優化

1.3.1 碳源的選擇

以10g/L蛋白胨為氮源，添加5g/L的葡萄糖、甘油、蔗糖、麥芽糖、糊精、可溶性淀粉作為碳源，篩選出最佳碳源。配制碳源0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0g/L和10g/L的不同LB培養基，篩選出最佳碳源的最適質量濃度。

1.3.2 氮源的選擇

以最適質量濃度的最適碳源為最佳碳源，添加10g/L的蛋白胨、酵母粉、豆餅粉、硫酸銨、硝酸鈉、尿素作為氮源，篩選出最佳氮源。配制氮源5、1 0、15、20、25g/L的培養基，篩選出最佳氮源的最適質量濃度。

1.3.3 無機鹽的影響

在LB液體培養基中添加KH2PO4和MgSO4無機鹽進行發酵試驗，添加KH2PO4終質量濃度分別為0、1.0、2.0、4.0、8.0、16g/L和32g/L，添加MgSO4使其終質量濃度分別為0、0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.2g/L，進行發酵培養，篩選出最佳無機鹽添加量。

1.4 發酵條件優化

1.4.1 誘導溫度的影響

以LB培養基為基礎，在37℃條件下培養菌液使其OD600nm達到0.5(約4h)時，加入誘導劑IPTG(終濃度為1 mm o l/L)，再分別轉移至2 7、3 2、37、4 2、4 7℃的恒溫搖床，進行發酵培養，篩選出最佳誘導溫度。

1.4.2 誘導pH值的影響

以L B培養基為基礎，加入下列不同的緩沖液(10mmol/L)[8]，再分別用NaOH調節液體LB培養基的pH值：pH5.5～6.0(2-(N-嗎啉代)乙磺酸緩沖液，MES)，pH6.5～7.0(取代磺酸哌嗪緩沖液，PIPES)，pH7.5～8.0(4-羥乙基呱嗪乙硫磺酸，HEPES)，進行發酵培養，篩選出最佳誘導pH值。

1.4.3 誘導時機的確定

以L B培養基為基礎，分別在接種后培養2、3、4、5、6 h時加入I P T G進行誘導，篩選出最適誘導時機。

1.4.4 誘導時間的確定

以L B培養基為基礎，分別誘導2、4、6、8、10h，篩選出最適誘導時間。

1.4.5 誘導劑量的確定

以LB培養基為基礎，加入IPTG至其終濃度分別為0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mmol/L，篩選出最適誘導劑量。

1.4.6 接種量的確定

以LB培養基為基礎，分別按接種體積分數為0.5%、1%、2%、3%、4%進行發酵培養，篩選出最適接種量。

1.4.7 裝液量的確定

以LB培養基為基礎，分別按25、50、75、100mL和125mL的裝液量(總體積250mL)進行發酵培養，篩選出最佳裝液量。

1.5 正交試驗優化發酵條件

在上述各單因素試驗的基礎上，選取碳源、氮源、pH值、誘導時機、誘導時間、IPTG添加量、接種量幾個主要影響因素，同時以菌體生物量、酶活力、目的蛋白表達量為考察指標，利用L18(37)正交試驗對以上單因素進行優化組合試驗，篩選出最佳高密度高表達的試驗方法。表1為正交試驗水平表。

表1 正交試驗因素水平Table 1 Coded values and corresponding real values of the optimization parameters tested in orthogonal array design

1.6 分析方法

1.6.1 菌體生物量測定

測定不同培養時期發酵液在600nm波長處的光密度值，用O D600nm表示。

1.6.2 酶活力測定

將發酵液于10000r/min離心5min，棄去上清液，用50mmol/L、pH7.0磷酸緩沖液重懸菌體，在1280psi(1psi=6.895kPa)條件下超高壓破碎，12000r/min離心10min，收集上清液作為粗酶液。將10μL酶液加入到190μL 1%的可溶性乙酸鈉緩沖溶液(50mmol/L，pH5.0)中，在95℃水浴中反應30min，用3,5-二硝基水楊酸(DNS)法測定還原糖[9]。酶活力單位定義：在上述反應條件下，每分鐘催化產1μmol麥芽糖的酶量為一個酶活力單位，記為U。

1.6.3 目的蛋白表達量的測定

按照1.6.2節方法制備粗酶液，用考馬斯亮藍染色法(Bradford法)測定粗酶液中的總蛋白質含量[10]。用15%分離膠和5%濃縮膠對粗酶液進行SDS-PAGE電泳，電泳完畢后的凝膠一半用考馬斯亮藍染色30min后用甲醇-乙酸脫色液脫色，另一半在90℃水浴里反應30min后用碘-碘化鉀進行染色[11]。用Bandscan分析SDS-PAGE電泳圖[12]，測定目的蛋白表達比例，結合總蛋白含量計算出目的蛋白表達量。

2 結果與分析

2.1 培養基成分對重組菌生長和目的蛋白表達的影響

2.1.1 碳源的影響

表2 不同碳源對菌體生物量和酶活力的影響Table 2 Effect of carbon source on cell density and amylase activity

由表2可知，葡萄糖對重組大腸桿菌的高密度高表達發酵中效果最好，可見，大腸桿菌對糖類的利用，單糖優于雙糖，這與普通微生物對碳源利用的規律一致[13]。雖然有報道以甘油代替葡萄糖作為細菌生長的碳源可減少代謝抑制物質——乙酸的積累，更易達到重組菌的高密度和外源蛋白的高表達[14]，但是在本研究中甘油效果仍然不及葡萄糖。如圖1所示，在葡萄糖質量濃度為1.0g/L左右時大腸桿菌菌體生物量和目的產物表達量都達到最高。而當葡萄糖質量濃度大于10g/L時，細菌生長以及其產物的表達受到明顯的抑制。

圖1 葡萄糖質量濃度對重組菌生長、相對酶活力及目的蛋白表達量的影響Fig. 1 Effect of glucose concentration on the growth, amylase activity and protein expression of recombinant E. coli

2.1.2 氮源的影響

表3 不同氮源對菌體生物量和酶活力的影響Table 3 Effect of nitrogen source on cell density and amylase activity

氮源是細胞生長、繁殖和酶生產必不可少的營養物質。因此，在微生物產酶發酵中，氮源是必不可少的重要原料。以1g/L的葡萄糖為碳源，考察10g/L的酵母粉、蛋白胨、豆餅粉、尿素、硫酸銨、硝酸鈉對細菌高密度高表達的影響。結果如表3所示：重組大腸桿BL21在分別以蛋白胨和酵母粉為氮源的培養基中生長良好，在硫酸銨和硝酸銨為氮源的培養基中略有生長，硝酸鈉和尿素不能作為其生長利用的氮源，因此選取酵母粉作為最適氮源。

圖2 酵母粉質量濃度對重組菌生長、相對酶活力及目的蛋白表達量的影響Fig. 2 Effect of yeast extract concentration on the growth, amylase activity and protein expression of recombinant E. coli

如圖2所示，酵母粉質量濃度達到15g/L時，酶活力和目的蛋白的表達都較高，隨著酵母粉質量濃度逐漸增大，菌體的生長增長不明顯，酶活力和目的蛋白表達量都有所降低?？赡苁怯捎谶^量的氮源是細菌的吸收營養物質的速度大于其利用速度，不利于其代謝。因此，酵母粉作為該發酵中氮源的最適質量濃度為15g/L。

2.1.3 無機鹽的影響

2.1.3.1 磷酸鹽的影響

大多數微生物發酵，需添加磷酸鹽、鎂、錳、鐵、鉀鹽和氯化物以維持適當的離子強度和滲透壓，雖然它們不是作為營養物，但有時對微生物的生長和產物生成會產生重大影響。尤其是無機磷酸鹽，會阻遏次級代謝物的合成。圖3結果顯示適量的磷酸鹽促進菌體生長和目的蛋白的表達，磷酸二氫鉀質量濃度在2g/L左右時菌體生物量、酶活和目的蛋白表達量都達到最高，因此2g/L的磷酸二氫鉀為最適的磷酸鹽質量濃度。

圖3 KH2PO4質量濃度對重組菌生長、相對酶活力及目的蛋白表達量的影響Fig. 3 Effect of KH2PO4 concentration on the growth, amylase activity and protein expression of recombinant E. coli

2.1.3.2 硫酸鎂的影響

鎂以離子狀態存在于菌體中，對多種酶的活性有促進作用。圖4結果顯示，添加硫酸鎂可促進菌體生長和目的蛋白的表達，當硫酸鎂質量濃度達到1.0g/L時，菌體生物量相對較高，相對酶活力和目的蛋白都達到最大，之后隨硫酸鎂質量濃度的繼續增加菌體濃度雖略有增加，但相對酶活力與目的蛋白表達量均下降，綜合考慮適宜的硫酸鎂質量濃度為1.0g/L。

圖4 MgSO4質量濃度對重組菌生長、相對酶活力及目的蛋白表達量的影響Fig. 4 Effect of MgSO4 concentration on the growth, amylase activity and protein expression of recombinant E. coli

2.2 發酵條件對重組菌生長和目的蛋白表達的影響

2.2.1 誘導溫度的影響

圖5 溫度對重組菌生長、相對酶活力及目的蛋白表達量的影響Fig. 5 Effect of cultivation temperature on the growth, amylase activity and protein expression of recombinant E. coli

培養溫度是影響細菌生長和調控細胞代謝的重要因素。如圖5所示，重組大腸桿菌在37℃生長較好，該溫度也是菌體產酶和目的蛋白表達較好的溫度，過高和過低都不利于菌體生長和蛋白表達。

2.2.2 誘導pH值的影響

微生物在一定的pH值環境中才能正常生長繁殖，如果pH值不適，不但妨礙微生物菌體的正常生長，還會改變微生物的代謝途徑和代謝產物的性質。本實驗采用加入緩沖液來保持培養基的pH值，以研究重組菌高密度和高表達的適宜pH值。如圖6所示，重組菌的生長適宜pH值為6.0～6.5，該pH值也利于菌株產酶，在pH值為6.5時目的蛋白表達量占總蛋白的比例較高，綜合各因素pH值為6.0較好。

圖6 pH值對重組菌生長、相對酶活力及目的蛋白表達量的影響Fig.6 Effect of pH on the growth, amylase activity and protein expression of recombinant E. coli

2.2.3 誘導時機的影響

圖7 誘導時機對重組菌生長、相對酶活力及目的蛋白表達量的影響Fig.7 Effect of induction time point on the growth, amylase activity and protein expression of recombinant E. coli

重組大腸桿菌通常在對數生長期進行誘導，其最佳的誘導起始時間需要針對不同的宿主菌及不同的質粒體系加以優化。如圖7所示，菌體在搖瓶中生長4h(菌體OD600nm達到0.5左右)時，對其進行誘導，相對酶活達到最高，目的蛋白得到最大表達，菌體生物量雖不斷增大，但不利于耐高溫α-淀粉酶的表達。

2.2.4 誘導時間的影響

圖8 誘導時間對重組菌生長、相對酶活力及目的蛋白表達量的影響Fig.8 Effect of induction duration on the growth, amylase activity and protein expression of recombinant E. coli

如圖8所示，加入IPTG后分別培養2、4、6、8h和10h。隨著誘導時間的延長，菌體濃度逐漸增大。酶活力與目的蛋白表達量先由迅速升高，而后略有下降趨勢，分別在4h和6h時達到高峰。從經濟角度及IPTG可能存在的副作用方面考慮，認為加入IPTG再誘導4h，利于重組菌的生長和目的蛋白的表達，4h為最適誘導時間。

2.2.5 誘導劑添加量的影響

圖 9 IPTG添加量對重組菌生長、相對酶活力及目的蛋白表達量的影響Fig.9 Effect of IPTG amount on the growth, amylase activity and protein expression of recombinant E. coli

誘導劑IPTG在培養基中不被利用，其濃度也比較穩定，但選擇不同的誘導濃度對目的基因的表達存在較大的影響。如圖9所示，IPTG添加量對重組菌的產酶活性有一定影響，而對菌體的生長影響不大，高濃度的IPTG對目的蛋白的表達不利，添加IPTG適宜的濃度為0.8mmol/L。

2.2.6 接種量的影響

接種量的大小對發酵周期的長短和產酶水平高低的影響較大，接種量過小則菌體生長緩慢，對數生長期延長，菌體培養時間延長，菌種活力降低，接種量過大，雖然縮短了培養時間，但菌種則容易衰老，酶活力不高，所以選擇合適的接種量對產酶影響較大[15]。圖10結果顯示，接種量為2%時，酶活力和目的蛋白表達量均達到達到最大，隨著接種量的繼續增加，雖然菌體生物量仍有所上升，但酶活力和目的蛋白表達量菌呈下降趨勢，綜合各因素考慮，最佳的接種量為2%。

圖 10 接種量對重組菌生長、相對酶活力及目的蛋白表達量的影響Fig.10 Effect of inoculum amount on the growth, amylase activity and protein expression of recombinant E. coli

2.2.7 裝液量的影響

圖11 裝液量對重組菌生長、相對酶活力及目的蛋白表達量的影響Fig.11 Effect of medium amount in shake flasks on the growth,amylase activity and protein expression of recombinant E. coli

培養過程中裝液量決定了培養瓶中的溶氧量，溶氧濃度是高密度發酵過程中影響菌體生長的重要因素之一。大腸桿菌的生長代謝過程需要氧的參與，溶氧量對菌體的生長和產物生成影響很大，溶氧量過高或過低都會影響細菌的代謝。由圖11可見，在50mL/250mL裝液量時菌體生物量最高，但當裝液量達到75mL/250mL時，酶活力和目的蛋白的表達同時達到最高，綜合各因素考慮，適宜的裝液量為75mL/250mL。

2.3 培養基成分及發酵條件優化的正交試驗結果

如表4所示，根據極差分析，各因素影響菌體生物量的順序為C＞D＞G＞F＞E＞A＞B，最優條件組合為A3B2C3D2E1F2G3，其中A、B、E因素影響不大，且當取得C3D2F2G3時發酵液菌體生物量最大；同理，影響酶活力的主次順序為D＞G＞C＞F＞E＞A＞B，最優組合為A1B1C3D2E3F2G3，其中B因素影響最小，當取得A1C3D2E3F2G3時發酵液酶活力最大；以目的蛋白表達量為考察指標，影響其的主次順序為G＞C＞D＞A＞B＞F＞E，最優組合為A1B2C3D2E1F2G3，其中E因素影響最不顯著，當取得A1B2C3D2F2G3時發酵液目的蛋白表達量最大。為獲得高密度、高表達的發酵結果，應同時考慮發酵液中菌體生物量、酶活力及目的蛋白表達量與各因素的關系，綜合以上3個結果的組合，最終確定最優發酵條件為A1B2C3D2E3F2G3，即葡萄糖0.5g/L，酵母粉15g/L，pH6.5，誘導時機為接種后發酵4h，誘導時間為6h，IPTG添加量為0.8mmol/L，接種量為3%。經過優化，該重組菌發酵液菌體生物量為原來的1.29倍，酶活力達到8.754U/mL，是原來的1.55倍，目的蛋白的表達量也為原來的1.24倍。

表4 培養基成分及發酵條件優化正交試驗結果Table 4 Orthogonal array design and results

3 結 論

通過搖瓶發酵試驗對產耐高溫α-淀粉酶大腸桿菌重組菌BL21培養基和培養條件的優化，確定了該菌高密度高表達發酵方案：葡萄糖0.5g/L酵母粉15g/LpH6.5，誘導時機為接種后發酵4h，誘導時間為6h，IPTG添加量為0.8mmol/L，接種量為3%。經優化后，該重組菌發酵液菌體生物量為原來的1.29倍，酶活力達到8.754U/mL，是原來的1.55倍，目的蛋白的表達量也為原來的1.24倍。該研究得到的高密度高表達的發酵參數可為發酵罐的放大實驗和工業化生產提供理論參考。

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Optimization of Fermentation Conditions for High Cell Density Cultivation and High Hyperthermophilicα-Amylase Expression in RecombinantE. coli

HU Jian-en1，CAO Qian1,2，YANG Fan1,2，FANG Yao-wei2，WANG Shu-jun2,*，LMing-sheng2，GE Liang3，LI Ying4

(1. College of Food Science and Engineering, Dalian Ocean University, Dalian 116023, China；2. School of Marine Science ,Huaihai Institute of Technology, Lianyungang 222005, China；3. College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China；4. School of Biothechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

In order to achieve high-cell-density cultivation and high expression of recombinantE. coliBL21 producing hyperthermophilicα-amylase, the medium composition and shake flask fermentation conditions were optimized using orthogonal array design. The optimal cultivation conditions for the production ofα-amylase were achieved by using a pH 6.5 medium composed of 0.5 g/L glucose and 15 g/L yeast extract and an inoculum size of 3%, and adding 0.8 mmol/L IPTG for 6 h induction after 4 h of fermentation. Under these conditions, the biomass of recombinantE. coliBL21 was increased by 1.29-fold, theα-amylase activity by 1.55-fold (reaching 8.754 U/mL) and the protein expression level by 1.24-fold compared to the preoptimization results.

hyperthermophilicα-amylase；E. coliBL21；cultivation medium；cultivation conditions

O623.54

A

1002-6630(2012)01-0219-07

2011-02-07

江蘇省科技廳農業科技支撐計劃項目(BE2008340)；江蘇省高校自然科學研究重大項目(09KJA170001)

胡建恩(1962—)，男，教授，博士，研究方向為生物資源利用。E-mail：huje@dlfu.edu.cn

*通信作者：王淑軍(1965—)，女，教授，博士，研究方向為海洋微生物及其活性物質。E-mail：shujunwang86@163.com