大豆蛋白的酶水解及類蛋白反應對其抗氧化活性的影響

宋佳天，趙新淮*

(乳品科學教育部重點實驗室，東北農業大學，黑龍江 哈爾濱 150030)

大豆蛋白的酶水解及類蛋白反應對其抗氧化活性的影響

宋佳天，趙新淮*

(乳品科學教育部重點實驗室，東北農業大學，黑龍江 哈爾濱 150030)

采用Alcalase 2.4L FG蛋白酶水解大豆蛋白，篩選并制備出ABTS+·清除率最高的水解物，其水解度為14.0%，對ABTS+·清除率為43.6%。以此水解物為底物，以修飾產物的游離氨基減少量為指標，應用響應面分析得到類蛋白反應的優化條件為：酶添加量1037U/g pro、底物質量濃度30g/100mL、溫度20℃。在此條件下反應6h，水解物的修飾反應程度和抗氧化活性均為最大。制備反應程度不等的3個修飾產物，進一步抗氧化活性分析表明：大豆蛋白水解物及其修飾產物的抗氧化活性好于大豆蛋白；修飾產物與水解物的DPPH自由基清除能力、還原力、超氧陰離子自由基(O2－·)清除率差別不顯著，但是對羥自由基(·OH)清除率差別顯著。

大豆蛋白水解物；類蛋白反應；抗氧化活性；響應面

已經證實，自由基引發的生物體氧化會導致細胞的死亡和組織損傷[1]，也是導致人體衰老的重要原因。抗氧化劑，如酚類化合物和抗氧化肽能夠保護機體免受自由基的傷害，并延緩某些慢性疾病的過程[2-3]。由酶水解蛋白質產生的生物活性肽，具有潛在的生理調節作用，其活性取決于氨基酸組成和序列[4]。基于這些結構，它們就很可能表現出某種活性，如抗氧化性[5-6]。

類蛋白(plastein)反應是酶催化的蛋白質水解的逆過程，由較低分子質量的肽形成類似于蛋白質的混合物[7]。在反應過程中由于同時存在水解作用、縮合作用、轉肽作用和物理聚集[8]，極有可能生成新結構組成的肽，從而影響其生物學活性。已有研究證實，酪蛋白水解物的類蛋白反應可以提高其抗氧化性[9]。為此，本實驗通過對大豆蛋白水解物的類蛋白反應修飾及其條件優化，研究Alcalase 2.4L FG蛋白酶催化的水解反應以及隨后的類蛋白反應對大豆蛋白水解物的抗氧化活性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白 哈爾濱高科技蛋白有限公司。

Alcalase 2.4L FG蛋白酶(酶活力1×105U/mL) 諾維信生物技術有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2-連氮-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)美國Sigma公司；鐵氰化鉀 天津市博迪化工有限公司；鄰二氮菲 天津市科密歐化學試劑開發中心；鄰苯三酚 浙江省溫州市甌海精細化工公司；其他試劑均為分析純，水為蒸餾水或超純水。

1.2 儀器與設備

UV-2401PC型紫外-可見分光光度計 日本島津公司；Kjeltec TM2300型自動凱氏定氮儀 瑞士Foss公司；LG-21M高速冷凍離心機 上海市離心機械研究所；LGJ-1型真空冷凍干燥機 上海醫用分析儀器廠；HZQ-F160型全溫振蕩培養箱 哈爾濱東聯電子技術開發有限公司；DELTA 320型精密pH計、AL204型分析天平 梅特勒-托利多儀器中國有限公司；QT-1型微型漩渦混合器 上海琦特分析儀器有限公司；YH-4BS型遠紅外恒溫干燥箱 天津市中環實驗電爐有限公司；DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 堿性蛋白酶大豆蛋白水解物的制備[10]

配制質量濃度為100mg/mL的大豆分離蛋白溶液，以2mol/L NaOH溶液調節pH值至8.0，Alcalase 2.4L FG蛋白酶添加量為1000U/g pro，50℃恒溫水浴中進行酶解。不同水解時間(0.5～7h)取出樣品20mL，迅速在100℃沸水浴中加熱15min，冷卻至室溫后以2mol/L HCl溶液調節pH值至4.5，然后8000×g離心15min，分離出上清液。測定各個上清液的蛋白質含量和游離氨基含量，計算其水解度。再將各個上清液稀釋至同一濃度，測定其ABTS+·清除率。

根據測定結果，確定適宜的水解時間，放大實驗制備ABTS+·清除率最高的大豆蛋白水解物，冷凍干燥后保存于－20℃備用。

1.3.2 大豆蛋白水解物的類蛋白反應條件優化

采用中心組合試驗，固定反應時間為6h，以反應體系的游離氨基減少量為響應值，參考李亞云等[11]的研究，分別研究酶添加量、底物質量濃度、反應溫度的影響，采用三因素五水平響應面分析方法，其因素水平編碼見表1。

表1 大豆蛋白水解物類蛋白反應條件響應面分析的因素水平編碼表Table 1 Coded values and corresponding actual values of the reaction parameters used in response surface analysis

1.3.3 指標測定

1.3.3.1 蛋白質含量、酶活力、游離氨基含量及蛋白質水解度測定

蛋白質含量的測定：凱氏定氮法[12]；蛋白酶活力的測定：福林-酚法[13]；游離氨基含量及蛋白質水解度(DH)的測定：鄰苯二甲醛法[14-15]。水解度計算公式[16]為：

式中：5.71為大豆蛋白質的換算系數；0.35為大豆分離蛋白的游離氨基含量/(mmol/g)；7.8為大豆蛋白的肽鍵含量/(mmol/g)；N1為大豆蛋白水解物的氮含量/(mg/mL)。

1.3.3.2 DPPH自由基的清除能力測定[17]

取D PPH 0.0 0 7 9g，以無水乙醇溶解并定容至100mL，配制成濃度為20μmol/L的乙醇溶液，放置于棕色瓶并暗處保存。將樣品適當稀釋以保證使分析時吸光度在0.7以下。取1mL DPPH溶液與2mL樣品溶液(5.0mg/mL)混合并及時在暗處放置反應30min，然后測定其在波長517nm處的吸光度。同時，利用無水乙醇進行空白實驗，平行實驗3次。DPPH自由基清除率的計算公式如下：

1.3.3.3 ABTS+·清除能力測定[18]

ABTS+·溶液由2mL ABTS+·溶液(7mmol/L)與1mL過硫酸鉀溶液(終濃度2.45mmol/L)反應產生；混合物在使用前于暗處室溫下保存12～16h。測定時，ABTS+·溶液用5mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.4)稀釋至波長734nm處的吸光度在0.7附近。30℃條件下50μL樣品溶液(2.0mg/mL)與5mL已稀釋的ABTS+·溶液混合，于1、4、6min測定其在734nm波長處的吸光度。每個樣品重復測定3次。以不含A B T S+·溶液的磷酸鹽緩沖液作空白。ABTS+·的清除率按式(3)計算。

式中：A0為波長734nm處空白的吸光度；A為波長734nm處樣品的吸光度。

1.3.3.4 還原力測定[19]

取5.0mg/mL的樣品液1mL，與2.5mL磷酸鈉緩沖液(0.2mol/L，pH6.6)和2.5mL 1%鐵氰化鉀溶液混合，50℃恒溫反應30min，迅速冷卻并加入2.5mL 10%的三氯乙酸溶液；5000×g離心10min，取2.5mL上清液，加入2.5mL蒸餾水和0.5mL 0.1%氯化鐵溶液，混勻。反應10min后，700nm波長處測定吸光度，并以此表示還原力。吸光度越大說明還原能力越強。

1.3.3.5 ·OH清除能力的測定[20]

取2.0mL 0.75mmol/L鄰二氮菲-磷酸鹽緩沖液(0.15mol/L，pH7.4)與2.0mL 0.15mol/L FeSO4磷酸鹽緩沖液(0.15mol/L，pH7.4)充分混合，然后加入1.0mL樣品溶液(5.0mg/mL)和1.0mL質量分數為0.01%的H2O2溶液；37℃保溫60min后，在波長536nm處測定吸光度。·O H清除率計算按式(4)計算。

式中：AS為樣品的吸光度；A1為含鄰二氮菲、FeSO4和H2O2的對照樣吸光度；A0為含鄰二氮菲和FeSO4的空白溶液的吸光度。

1.3.3.6 O2－·清除能力的測定[21]

采用鄰苯三酚自氧化方法。首先，1.0mL樣品溶液(1.0mg/mL)與1.8mL 50mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.2)混合；25℃保溫反應10min，加入0.1mL 10mmol/L鄰苯三酚溶液(溶于10mmol/L的HCl)。于320nm波長處測定溶液的吸光度，每30s讀數一次，讀數總時間為4min。鄰苯三酚氧化速率由吸收率曲線的斜率(ΔA1)表示。空白樣鄰苯三酚的自氧化速率測定以1.0mL雙蒸水代替樣品溶液進行測定得到。O2－·清除率按式(5)計算。

式中：ΔA0和ΔA1分別為空白樣、樣品測定時的吸光度曲線斜率。

1.3.4 數據統計分析

采用Excel2003軟件、SPSS13.0軟件和Design Expert7.0軟件對數據進行處理、統計分析和繪圖。

2 結果與分析

2.1 大豆蛋白水解物的制備

由圖1可見，大豆蛋白水解物的抗氧化性隨著其水解度的增大而增大。顯著性分析發現，在水解時間為6h時，大豆蛋白水解物的水解度為14.0%，對ABTS+·的清除率達到43.6%；統計分析則顯示，如果水解時間延長至7h，水解物的ABTS+·清除率無顯著提高(P≥0.05)。故此，制備水解度為14.0%的水解物為隨后進行的類蛋白反應的底物。

2.2 類蛋白反應條件的優化

圖1 大豆蛋白水解物的水解度和ABTS+·清除率Fig. 1 Effect of hydrolysis time on degree of hydrolysis and ABTS+ radical scavenging rate of SPI hydrolysates

利用Alcalase 2.4L FG蛋白酶對所制備的大豆蛋白水解物進行類蛋白反應，參照吳丹等[9]的研究結果，固定反應時間6h，并按照中心組合試驗進行20組試驗。應用Design Expert7.0軟件作響應面曲面圖，分析酶添加量、底物濃度和溫度對修飾產物游離氨基減少量的影響(各個響應面中，另一條件為零水平條件)，結果如圖2所示。

圖2a、b、c分別表示酶添加量與底物質量濃度、酶添加量與溫度、底物質量濃度與溫度對類蛋白反應體系中游離氨基減少量(Y)的影響。將試驗數據進行二次多項回歸擬合，剔除不顯著的因素后得到二次多項式回歸方程如下：Y=－98.05488＋5.57190X2＋6.98181X3＋0.14064X2X3－1.25957×10－4X12－0.16811X22－0.25260X32。

以類蛋白反應后產物的游離氨基減少量為指標，通過方程式的求解，得到反應的最優條件為：酶添加量1037U/g pro、底物質量濃度30g/100mL、溫度20℃。此條件下游離氨基減少量的理論值為177μmol/g pro；驗證實驗表明3次實驗結果的平均值為171μmol/g pro，表明預測結果與實際情況很好的相符。,

圖2 類蛋白反應條件對反應體系中游離氨基減少量的影響情況Fig.2 Response surface plots showing the interaction effects of the reaction parameters on the reduction of free amino groups

2.3 大豆蛋白水解物類蛋白反應修飾產物的抗氧化活性

2.3.1 大豆蛋白水解物類蛋白反應修飾產物的ABTS+·清除率

在酶添加量1037U/g pro、底物質量濃度30g/100mL 、溫度20℃的條件下，對大豆蛋白水解物進行修飾，在反應時間為1～8h條件下得到8個修飾產物。通過分析發現，反應體系的游離氨基減少量隨反應時間變化而不規則變化(圖3) ，其范圍在92.6～169.0μmol/g pro。在反應的開始，體系中的游離氨基含量逐漸減小，而反應6h后呈現增加，說明反應時間過長可導致修飾產物重新始水解。最為重要的是，修飾產物對ABTS+·的清除率在反應時間為3～7h得到顯著提高(顯著高于大豆蛋白水解物或大豆蛋白)，并且在反應時間為6h的情況下，清除率達到最大(圖3)。

圖 3 大豆蛋白水解物類蛋白反應修飾產物的游離氨基減少量與ABTS+·清除率Fig. 3 Effect of plastein reaction time on the reduction of free amino groups and ABTS+ radical scavenging rate of modified SPI hydrolysates

2.3.2 大豆蛋白水解物類蛋白反應修飾產物的其他抗氧化活性

根據修飾產物的游離氨基減少量的高低不同，選取游離氨基減少量分別處于低、中、高水平(反應時間 1、3、6h)的 3個修飾產物進一步評價它們的其他抗氧化活性，進一步揭示類蛋白反應修飾對大豆蛋白水解物抗氧化活性的影響，結果見表2。

整體上看，大豆蛋白水解物、修飾產物的抗氧化活性遠遠好于大豆蛋白。在對·OH清除率上，類蛋白反應修飾顯著地提高了大豆蛋白水解物的修飾產物的抗氧化活性；但是，在對還原力、DPPH自由基清除率和O2－·三個方面，修飾反應帶來的影響作用不顯著。此外，不同反應程度的修飾產物之間的抗氧化活性差別不是十分大。不過，總體上看類蛋白反應確實能夠提高大豆蛋白水解物的抗氧化活性。所以，大豆蛋白水解物的Alcalase 2.4L FG蛋白酶水解、耦合類蛋白反應修飾，可以應用于制備高活性大豆蛋白抗氧化肽。

3 結 論

3.1 用 Alcalase 2.4L FG蛋白酶對大豆蛋白水解，根據不同水解度的水解物對ABTS+·的清除率，確定抗氧化性較好的水解物制備條件為：溫度50℃、pH8.0、酶添加量1000U/g pro和水解反應6h。所得到的大豆蛋白水解物的水解度為14.0%，對ABTS+·的清除率為43.6%。

3.2 應用響應面設計方法，以反應體系游離氨基減少量為響應值，固定反應時間6h，對大豆蛋白水解物的類蛋白修飾反應條件進行優化，以修飾產物的游離氨基減少量為指標，結果得到：酶添加量1037U/g pro、底物質量濃度30g/100mL、溫度20℃；此條件下游離氨基減少量的理論值為177μmol/g，與實際值(171μmol/g)接近。在優化條件下反應6h，所得到的修飾產物的反應程度最大且ABTS+·清除率也最高。

3.3 采用DPPH自由基清除率、還原力、·OH清除率和O2－·清除率4個評價指標，對反應程度不同的3個反應程度不同的大豆蛋白水解物類蛋白反應修飾產物進行評價，發現大豆蛋白水解物和修飾產物的抗氧化性活性遠遠好于大豆蛋白；修飾產物的DPPH自由基清除率和還原力與水解物沒有差異，而修飾產物的·OH清除率和O2－·清除率顯著高于水解物，顯示類蛋白反應修飾可以在一定程度上提高大豆蛋白水解物的抗氧化活性。

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Effects of Enzymatic Hydrolysis and Subsequent Plastein Reaction on Antioxidant Properties of Soybean Protein Isolate

SONG Jia-tian，ZHAO Xin-huai*
(Key Laboratory of Dairy Science, Ministry of Education, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

Alcalase 2.4L FG was used to hydrolyze soybean protein isolate (SPI) to prepare soybean protein hydrolysates with the highest antioxidant activity, which showed a degree of hydrolysis of 14.0% and an ABTS+radical scavenging rate of 43.6%. The prepared hydrolysates were modified with Alcalase 2.4L FG by plastein reaction and the optimal enzyme dosage, substrate concentration and temperature to maximize the reduction of free amino groups were determined by response surface methodology to be 1037 U/g protein, 30 g/100 mL, and 20 ℃, respectively. The maximum degree of reaction and antioxidant activity were obtained after reaction for 6 h under these conditions. Moreover, the antioxidant activity of the SPI hydrolysates and their modification products obtained after reaction for 1, 3 h and 6 h was better than that of SPI. The DPPH and superoxide anion radical scavenging activity and reducing power of the hydrolysates and modification products showed no significant difference, while a significant difference was observed in their hydroxyl radical scavenging activity.

soybean protein hydrolysates；plastein reaction；antioxidant activity；response surface analysis

Q814.9

A

1002-6630(2012)01-0115-05

2011-03-15

國家自然科學基金項目(30972132)；黑龍江省高等學校科技創新團隊建設計劃項目(2010td11)

宋佳天(1985—），女，碩士研究生，主要從事食品科學研究。E-mail：sjiatian@gmail.com

*通信作者：趙新淮(1963—），男，教授，博士，主要從事食品化學研究。E-mail：zhaoxh@mail.neau.edu.cn