赤丹皮中芍藥苷的不同提取工藝研究

周 濃，謝 靜，胡廷章，郭 清

（1.重慶三峽學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，重慶 404000；

2.重慶市食品藥品檢驗(yàn)所中藥室，重慶 401121；

3.大理學(xué)院藥學(xué)院，云南大理 671000）

赤丹皮中芍藥苷的不同提取工藝研究

周 濃1，3，謝 靜2，胡廷章1，郭 清3

（1.重慶三峽學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，重慶 404000；

2.重慶市食品藥品檢驗(yàn)所中藥室，重慶 401121；

3.大理學(xué)院藥學(xué)院，云南大理 671000）

對(duì)赤丹皮中芍藥苷進(jìn)行提取工藝的考察。采用水浴法、回流提取和超聲提取后經(jīng)HPLC進(jìn)行含量測定。利用正交分析，得到3種提取工藝的最優(yōu)條件為：水浴法：50%乙醇，提取1h，料液比為1∶450，提取2次，最佳工藝條件提取芍藥苷提取含量為27.217mg/g；回流提取法：50%乙醇，提取時(shí)間2h，料液比1∶450，提取3次，采用其最佳工藝條件提取芍藥苷提取含量為26.688mg/g；超聲提取法：90%乙醇，提取時(shí)間30min，料液比1∶450，提取3次，采用其最佳工藝條件提取芍藥苷提取含量為30.468mg/g。建立的方法簡便、可靠，重復(fù)性好，可為赤丹皮的全面研究提供一定的數(shù)據(jù)參數(shù)。

赤丹皮，芍藥苷，提取工藝

赤丹皮為毛茛科植物黃牡丹Paeonia delavayi Franch.var.lutea（Delavay ex Franch.）Finet et Gagnep.的干燥根皮，具有通經(jīng)涼血、散瘀止痛的功效，臨床用于吐血、尿血、血痢、腹痛、痛經(jīng)、月經(jīng)不調(diào)，在云南作為牡丹皮使用[1]。黃牡丹特產(chǎn)于我國云南、四川西南部及西藏東南部，是國家三級(jí)重點(diǎn)保護(hù)的珍稀植物[2]。目前關(guān)于赤丹皮的研究資料表明，其含芍藥苷、丹皮酚、揮發(fā)油及植物甾醇等多種化學(xué)成分[3-4]，其主要有效單體成分芍藥苷具有神經(jīng)保護(hù)、抗抑郁、鎮(zhèn)痛、保肝、降血糖、抑制腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等作用[5-6]。目前對(duì)芍藥苷的提取主要是采用水浴提取法[7]、回流提取法[8]、超聲提取法[9]、索氏提取法[10]、加速溶劑提取法[11]、微波提取法[12]和超臨界流體提取法[13]等，目前多采用芍藥對(duì)芍藥苷進(jìn)行提取研究[7-13]，未見赤丹皮中芍藥苷提取工藝系統(tǒng)研究的報(bào)道。為深入研究其藥用價(jià)值，提高其提取工藝的科學(xué)性和合理性，本實(shí)驗(yàn)以赤丹皮中芍藥苷含量為指標(biāo)，綜合幾種常用的工藝對(duì)赤丹皮中芍藥苷進(jìn)行提取考察，采用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選其最佳提取工藝，以期為開發(fā)赤丹皮在醫(yī)藥保健、食品工業(yè)等相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用提供一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

芍藥苷對(duì)照品 中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110736-200934，供含量測定用；乙腈 為色譜純，德國默克公司；水 為娃哈哈牌純凈水；其他試劑 均為分析純；赤丹皮樣品 于2010年6月采集于云南省大理市花甸壩，并經(jīng)作者本人鑒定為毛茛科植物黃牡丹Paeonia delavayi var.lutea的干燥根皮。

1100 LC型高效液相色譜儀 美國Agilent公司；KQ-250B型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；DKS-28型恒溫水浴鍋 嘉興市中新醫(yī)療儀器有限公司；RE-2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；SHZ-Ⅲ型循環(huán)水式真空泵 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；AE240型天平 梅特勒-托利多儀器上海有限公司；FZ102型微型植物試樣粉碎機(jī) 北京中興偉業(yè)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 芍藥苷提取工藝流程 赤丹皮洗凈→烘干粉碎→過40目篩→按一定比例加入乙醇→不同方法提取→過濾→減壓濃縮蒸干→甲醇溶解定容→HPLC檢測→計(jì)算提取率

1.2.2 芍藥苷含量的分析方法

1.2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 色譜柱：Agilent TC-C18柱（4.6mm×150mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸溶液（12∶88）；檢測波長：235nm；流速：1.0m L/m in；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL。對(duì)照品和黃牡丹樣品分離的色譜圖見圖1。

1.2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 取芍藥苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1m L含400μg的溶液，即得。

1.2.2.3 線性關(guān)系考察 分別精密吸取對(duì)照品溶液（含芍藥苷400μg/m L）1、2、4、6、8、10μL，注入液相色譜儀，得進(jìn)樣量C（μg）與峰面積A的線性方程。結(jié)果表明，芍藥苷進(jìn)樣量在0.40～4.00μg與峰面積成良好的線性關(guān)系，回歸方程為A=1095.3C+31.608，r= 0.9999（n=6）。

1.2.3 提取芍藥苷工藝的研究 首先進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，考察乙醇濃度、浸提時(shí)間、料液比、提取次數(shù)對(duì)芍藥苷得率的影響。為了考查各因素之間的相互影響，設(shè)計(jì)四因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)，確定水浴提取法（表1）、回流提取法（表2）、超聲提取法（表3）提取芍藥苷的最佳條件。

表1 水浴提取法正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Tablel 1 Factors and levels table of orthogonal testby water extractionmethod

表2 回流提取法正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 2 Factors and levels table of orthogonal testby refluxing extractionmethod

圖1 對(duì)照品及樣品的HPLC圖Fig.1 HPLC chromatograms of reference substance and sample

表3 超聲提取法正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 3 Factors and levels table of orthogonal testby ultrasonic extractionmethod

2 結(jié)果與分析

2.1 水浴提取法提取芍藥苷工藝的研究

單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定水浴提取法提取芍藥苷的適宜條件為：乙醇濃度50%，提取時(shí)間1h，料液比1∶300，提取次數(shù)3次，在此基礎(chǔ)上以提取含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)（表1），結(jié)果見表4、表5。

表4 水浴提取法正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表Table 4 Results table of orthogonal testby water extractionmethod

表5 水浴提取法正交實(shí)驗(yàn)方差分析表Table 5 Variance analysis table of orthogonal testby water extractionmethod

由表2極差R值可知，各因素影響情況為：料液比＞提取次數(shù)＞提取時(shí)間＞濃度。通過直觀分析在實(shí)驗(yàn)條件下，粗提工藝最佳組合是：50%乙醇，提取時(shí)間1h，料液比1∶450，提取次數(shù)2次。經(jīng)方差分析得知：芍藥苷水浴提取法的因素對(duì)結(jié)果均有一定影響，但差異性不顯著。

2.2 回流提取法提取芍藥苷工藝的研究

單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定回流提取法提取芍藥苷的適宜條件為：乙醇濃度70%，提取時(shí)間2h，料液比1∶300，提取次數(shù)2次，在此基礎(chǔ)上以提取率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)（表2），結(jié)果見表6、表7。

表6 回流提取法正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表Table 6 Results table of orthogonal testby refluxing extractionmethod

由表5極差R值可知，各因素影響情況為：料液比＞提取次數(shù)＞提取時(shí)間＞濃度。通過直觀分析在實(shí)驗(yàn)條件下，粗提工藝最佳組合是：50%乙醇，提取時(shí)間2h，料液比1∶450，提取次數(shù)3次。經(jīng)方差分析得知：芍藥苷回流提取法的因素對(duì)結(jié)果均有一定影響，但差異性不顯著。

表7 水浴法正交實(shí)驗(yàn)方差分析表Table 7 Variance analysis table of orthogonal test by refluxing extractionmethod

2.3 超聲提取法提取芍藥苷工藝的研究

單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定超聲提取法提取芍藥苷的適宜條件為：乙醇濃度70%，提取時(shí)間30min，料液比1∶450，提取次數(shù)2次，在此基礎(chǔ)上以提取率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)（表3），結(jié)果見表8、表9。

表8 超聲提取法正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表Table 8 Results table of orthogonal testby ultrasonic extractionmethod

表9 超聲法正交實(shí)驗(yàn)方差分析表Table 9 Variance analysis table of orthogonal test by ultrasonic extractionmethod

由表8極差R值可知，各因素影響情況為料液比＞濃度＞提取次數(shù)＞提取時(shí)間。通過直觀分析在實(shí)驗(yàn)條件下，粗提工藝最佳組合是：90%乙醇，提取時(shí)間30min，料液比1∶450，提取次數(shù)3次。經(jīng)方差分析得知：利用超聲提取法來提取芍藥苷時(shí)，料液比對(duì)提取有顯著性影響。

2.4 最佳工藝條件的驗(yàn)證

正交實(shí)驗(yàn)的最佳工藝參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，平行測定5次，結(jié)果見表10。由表10可知應(yīng)用最佳工藝參數(shù)進(jìn)行粗提實(shí)驗(yàn)，提取結(jié)果穩(wěn)定。

表10 三種提取方法正交驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)Table 10 Orthogonal validation testby three extractionmethods

3 結(jié)論與討論

芍藥苷作為芍藥類藥材的一種主要有效成分，鑒于其廣泛而獨(dú)特的藥理活性及臨床應(yīng)用，有進(jìn)一步研究的價(jià)值和開發(fā)成單體藥物的前景[5，14]。但一直以來，以白芍、赤芍的提取研究為多，本實(shí)驗(yàn)同時(shí)對(duì)白芍、赤芍的商品藥材參考中國藥典（2010年版一部）白芍、赤芍[15]含量測定項(xiàng)下采用赤丹皮的超聲提取法最佳工藝進(jìn)行芍藥苷測定，分別為20.182、25.526mg/g，結(jié)果表明赤丹皮中芍藥苷含量略高于白芍和赤芍。本實(shí)驗(yàn)首次對(duì)赤丹皮進(jìn)行芍藥苷的提取工藝研究，得到3種常用方法的工藝數(shù)據(jù)，揭示了赤丹皮作為提取原料的可行性，并為赤丹皮的進(jìn)一步研究開發(fā)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，同時(shí)也為提取方案的選擇提供相應(yīng)支持。

本實(shí)驗(yàn)比較了3種不同提取方法，從測定的芍藥苷含量來看，差異性不大。水浴提取法是最能進(jìn)行工廠化生產(chǎn)的方法之一，實(shí)驗(yàn)所得工藝參數(shù)為50%乙醇、提取1h、料液比1∶450、提取2次。提取含量為27.217mg/g，RSD為1.26%，且成本較低、操作方便，適宜于工業(yè)化生產(chǎn)。回流提取法耗時(shí)較長，使用此種方法需要綜合考慮經(jīng)濟(jì)和時(shí)間成本，同時(shí)其提取率較低。該法所得工藝的最優(yōu)組合是50%乙醇，提取時(shí)間2h，料液比1∶450，提取3次，芍藥苷的平均提取含量為26.688mg/g，RSD為0.37%。超聲提取法的最優(yōu)工藝參數(shù)為90%乙醇，提取時(shí)間30min，料液比1∶450，提取3次，芍藥苷的平均提取率為30.468mg/g，RSD為1.13%，該法具有提取率高和提取時(shí)間最短，可作為實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)的首選方法之一。

綜上所述，不同的提取工藝各具優(yōu)勢(shì)，在今后的研究和生產(chǎn)中可根據(jù)具體條件選擇合適提取方法進(jìn)行。通過此研究，在拓寬芍藥苷提取來源的同時(shí)，也對(duì)赤丹皮中芍藥苷提取工藝的空白進(jìn)行一定補(bǔ)充，這對(duì)于今后赤丹皮的系統(tǒng)研究具有指導(dǎo)作用。

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Research of different extraction process of paeoniflorin from root bark of Paeonia delavayi var.lutea

ZHOU Nong1，3，XIE Jing2，HU Ting-zhang1，GUO Qing3
（1.College of Life Science and Engineering，Chongqing Three Gorges University，Chongqing 404000，China；
2.Chongqing Institute for Food and Drug Control，Chongqing 401121，China；
3.College of Pharmacy，Dali University，Dali671000，China）

To study the extraction p rocess of paeoniflorin in root bark of Paeonia delavayi var.lutea.The paeoniflorin was extracted by water，reflux extraction and ultrasonic extraction and the contentwas assayed by HPLC.Using orthogonal experiments analysis，the op timal extraction cond itions of three extraction p rocess were as follows：the water bath extraction method：50%ethanol，extraction time 2h，ratio ofmaterial to solvent 1∶450，extract 2 times.Content of the op timum cond itions of extraction of paeoniflorin was 27.217mg/g.The reflux extrac tion method：50%ethanol，extraction time 2h，ratio of material to solvent 1∶450，extract 3 times. Content of the op timum cond itions of extraction of paeoniflorin was 26.688mg/g.The ultrasonic cell crushing extrac tion method：90%ethanol，extrac tion time 30m in，ratio ofmaterial to solvent 1∶450，extract3 times.Content of the op timum cond itions of extrac tion of paeoniflorin was 30.468mg/g.Methods estab lished were sim p le，reliab le and rep roducib le，which could p rovide data basis in a com p rehensive study of root bark of P.delavayi var.lutea.

Paeonia delavayi var.lutea；paeoniflorin；extraction p rocess

TS201.1

B

1002-0306（2012）22-0272-04

2012－05－28

周濃（1978-），男，副教授，主要從事藥用植物栽培與質(zhì)量控制。

重慶市高校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)計(jì)劃項(xiàng)目（201040）。