富鍺木耳菌絲體主要化學成分分析

朱蘊蘭

（徐州工程學院，江蘇徐州 221111）

富鍺木耳菌絲體主要化學成分分析

朱蘊蘭

（徐州工程學院，江蘇徐州 221111）

以木耳為研究材料，采用深層液體培養的方法獲得富鍺木耳菌絲體。測定了富鍺木耳菌絲體的主要化學成分含量。結果表明，木耳液體深層培養在鍺濃度400μg/mL時，菌絲體生物量、胞內多糖、蛋白質、鳥苷、胞苷含量均達到最高，分別為10.11、106.80、117.52、10.59、11.65mg/g，分別比空白對照提高了10.86%、16.56%、15.27%、49.58%、29.36%。富鍺木耳菌絲體氨基酸含量在鍺濃度為600μg/mL時含量最高為82.18mg/g，比空白對照提高了11.58%。菌絲體有機鍺含量在鍺濃度為800μg/mL時最高，達到8.67mg/g，比空白對照增加了57.8倍。在鍺濃度實驗范圍內木耳菌絲體中有機鍺含量則隨著鍺濃度的升高而增加。木耳菌絲體中胞內多糖、氨基酸、蛋白質、鳥苷、胞苷等含量均隨著鍺濃度的上升呈現先增后減的趨勢，鍺在低濃度時對上述生物學指標有促進作用，在高濃度時對其有抑制作用。

木耳，深層液體培養，鍺，化學成分

木耳（Auricularia auricula），別名黑木耳、光木耳，屬擔子菌綱，木耳目，木耳科，是人們主要的食用菌之一，在各國各地都有分布。主要在櫟、楊、榕、槐等一百二十多種闊葉樹的腐木上，單生或群生[1]。木耳是一種藥食兼用的真菌，既有營養，味道又鮮美，而且蛋白質、維生素、鈣、粗纖維、鐵等物質的含量都十分豐富，此外還含有多種微量元素和對人體有益的氨基酸，被稱做“素中之葷”。木耳具有益氣、潤肺、補腦以及促進血液循環等功能，可以抗血栓、抗凝血、軟化血管，防止心肌梗塞以及預防和治療高脂血癥、動脈硬化、冠心病，減少心血管疾病的發病率。木耳還可以有助于體內代謝廢物的排除，促進胃和腸道的蠕動，化解膽結石和腎結石，預防便秘和結腸癌的發生，同時具有防止肥胖和增強機體免疫的能力。木耳對脂質過氧化有抑制作用，可以延緩衰老，并預防和治療多種老年疾病[2-5]。鍺屬于稀有元素，在土壤、植物中的含量一般較低，但有機鍺具有增加體內含氧量、清除自由基、抗炎、滋補、強身、抗癌、抗突變和增強免疫的作用[6-8]。已有研究證實食用菌菌絲體對鍺富集能力較強，可以使無機鍺轉化為菌絲體中的有機鍺，降低毒性，增加有機鍺的利用率，提高鍺的生物效應，同時能更好地改善食用菌的品質。有關食用菌對鍺富集的研究已有一些[9-10]報道，但木耳對鍺的富集研究尚未見報道，本研究試圖通過木耳的生物轉化作用將無機鍺轉化為有機鍺，并研究木耳在不同鍺濃度環境下，主要化學成分含量的變化，為進一步開發木耳產品，提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

木耳（Auricularia auricula） 江蘇徐州豐縣大山河食用菌生產基地提供；斜面培養基 葡萄糖4%、酵母膏1%、蛋白胨1%、瓊脂2%、去離子水；液體種子培養基 葡萄糖3%、蛋白胨1%、硫酸鎂0.05%、磷酸二氫鉀0.2%、氧化鍺350μg/m L、去離子水；發酵培養基 葡萄糖2%、酵母膏0.2%、硫酸鎂0.1%、磷酸二氫鉀0.2%、去離子水；鍺標準液 國家鋼鐵材料測試中心鋼鐵研究總院；氧化鍺 國藥集團化學試劑有限公司。

HYG-Ⅱ型回轉式恒溫調速搖瓶柜 上海欣蕊自動化有限公司；GPH-9160型隔水式恒溫培養箱 上海一恒科學儀器有限公司；GZX-DH 40X45-BC型電熱恒溫干燥箱 上海躍進醫療器械廠；HH-4型數顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；FA-210N型電子天平 上海精密儀器有限公司；YXQ-SG41-280型手提式壓力蒸汽滅菌器 上海醫用核子設備廠；82-1型低速離心機 常州國華電器有限公司；SHB-Ⅲ型循環水式多用真空泵 鄭州長城科工有限公司；XT-9900型智能微波消解儀 中國上海新拓微波溶樣測試技術有限公司；XT-9700型冷卻機 中國上海新拓微波溶樣測試技術有限公司；TAS-990型原子吸收分光光度計、CW-2000型超聲-微波協同萃取儀、TU-1810型紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 木耳富鍺培養 活化后的菌種→斜面培養 （23℃，5～7d）→搖瓶種子培養（250mL三角瓶裝樣量100mL，23℃，120r/min，5～7d）→富鍺擴大培養（10%的接種量接入不同鍺含量的發酵培養基，23℃，120r/min，5～7d）。

1.2.2 木耳菌絲體干粉的制作 將發酵液經減壓抽濾得到菌絲體，然后將菌絲體置于50℃干燥箱中干燥至恒重，研磨成粉末，裝入小塑料袋，放入干燥器內備用。

1.2.3 生物量的測定 將發酵液抽濾得到菌絲體，經干燥至恒重，稱量，即為生物量。

1.2.4 多糖的提取及測定方法 采用水提醇析的方法提取多糖[11]，取0.15g菌絲粉加水50m L于80℃水浴鍋中水浴1h，抽濾取濾液；如此重復三次，將三次抽提液合并，濃縮到約20m L，加3倍體積的95%乙醇，于冰箱中靜置醇析過夜后取出，4800r/m in離心10m in，沉淀物加水定容到250m L容量瓶中待用[12]。多糖的測定采用苯酚—硫酸法，根據標準回歸方程測定樣品多糖含量。多糖含量的計算方法：

多糖含量（%）=（測得多糖溶液的多糖含量×稀釋倍數×多糖溶液體積/樣品重量）×100

1.2.5 有機鍺含量的測定 a.菌絲粉用透析袋透析2d，每天換2～3次水，將其中的無機鍺透析掉[13]。b.微波消解（微波消解階段設置：功率為80%，壓力為10kPa，時間300s），得到消解液于冷卻機中趕酸30m in，定容到10m L容量瓶中，待測[14]。c.鍺含量測定用火焰原子吸收分光光度計（波長265.2nm，工作電流5mA，燃氣流量2000m L/m in，燃燒高度5.0mm，負高壓350V，光譜帶寬0.4nm）測定其吸光度，并通過標準回歸方程計算該樣品中有機鍺的含量[15]。d.鍺標準曲線繪制于10m L容量瓶內準確取1m L鍺標準溶液，加1%硝酸定容。分別取1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0m L于1m L容量瓶中，加5μg基體改進劑硝酸鎳[16]，用1%硝酸定容，用上述方法測定，并求回歸方程。

1.2.6 蛋白質含量測定 采用考馬斯亮蘭方法測定，以純牛血清蛋白為對照。標準曲線制作：分別吸取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6m L蛋白溶液，用0.15mol/L NaCl補充至1.0m L；加入5.0m L考馬斯亮藍試劑，作用5～30m in后于595nm下測吸光度，以1.0m L水按同樣操作為空白，以吸光度值為縱坐標，多蛋白質濃度為橫坐標[17]，得標準曲線，并求回歸方程。樣品測定的按照上述操作步驟操作，測出樣品的A595nm的吸光度值，然后依據標準回歸方程計算出樣品中的蛋白質含量。

1.2.7 氨基酸含量測定 a.制備氨基酸標準溶液：精確稱取0.1g在105℃干燥箱中干燥至恒重的L-丙氨酸，用純水溶解并且定容到100m L，即得到1g/L的標準氨基酸溶液。b.茚三酮試劑的制備：于100m L容量瓶中準確稱取2g水合茚三酮，用少量95%乙醇溶解并定容至刻度，制得20g/L的茚三酮水溶液。c.繪制L-丙氨酸標準曲線：分別吸取1g/L的氨基酸標準液0、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0m L于容量瓶中，再用緩沖溶液定容至50m L，得到濃度為60、70、80、90、100mg/L的氨基酸溶液。然后于5支試管中分別準確吸取上述試液5m L，取5m L純水于對照試管中，再分別加入1.0m L茚三酮試劑置于各支試管中，加塞并搖勻。將6支試管一起放入沸水浴（92℃）中，25m in后取出，溶液變為藍紫色，冷卻至室溫，在569nm下測其吸光度值[18]，并求標準回歸方程。d.樣品測定：稱取干燥粉碎過篩好的木耳菌絲體0.1g，加入50m L蒸餾水，在60℃下超聲波（600W，55kHz）提取110s，重復抽提3次，合并抽提液，用純水定容至100m L，再于試管中取5.0m L提取液，將木耳提取液用純水稀釋至25m L，定容，搖勻。按1.2.5中c.方法進行操作，測其吸光度，根據標準回歸方程計算總氨基酸含量[19]。

1.2.8 鳥苷、胞苷的提取 精確稱取0.3g木耳菌絲體3份，分別溶于50m L蒸餾水，選用超聲波-微波協同萃取儀中微波和超聲波協同作用（微波時間110s，功率200W，超聲波頻率40kHz，功率50W）重復提取3次，提取后離心過濾，稀釋定容至250m L[20]。

1.2.9 鳥苷、胞苷的測定 精密稱取10mg鳥苷、胞苷標準品，用純水溶解，稀釋定容至100m L，制備成100mg/L標準儲備液。利用100mg/L的鳥苷、胞苷母液，分別配制0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mg/L的鳥苷、胞苷溶液，紫外分光光度計全波段掃描1.0mg/L的鳥苷、胞苷標準品，分別在215、229nm波長處測定鳥苷和胞苷的最大吸收峰。以鳥苷、胞苷質量濃度（mg/L）為橫坐標X，吸光度為縱坐標Y，制作鳥苷、胞苷標準曲線，將提取好的樣品按上述方法測定其吸光度，根據標準曲線，計算鳥苷和胞苷的質量濃度。鳥苷、胞苷含量計算：

鳥苷、胞苷含量（mg/g）＝鳥苷、胞苷質量濃度×稀釋體積/木耳菌絲體質量

2 結果與分析

2.1 鍺濃度對木耳菌絲體生物量的影響

在不同鍺濃度培養條件下木耳菌絲體的生物量如圖1所示。

圖1 不同鍺濃度下木耳菌絲體的生物量Fig.1 The biomass of Auricularia auricular mycelia in different concentration of Ge

由圖1結合方差分析，鍺濃度對木耳菌絲體生物量存在極顯著影響（p＜0.01），當濃度為400μg/m L時菌絲體生物量最多，達10.11mg/m L，比空白對照提高10.86%。

2.2 鍺濃度對木耳菌絲體胞內多糖含量的影響

根據實驗得到多糖含量標準回歸方程為：y= 0.0179x+0.085，R2=0.9545，根據標準方程計算得到不同鍺濃度培養條件下木耳菌絲體胞內多糖含量如圖2所示。

圖2 不同鍺濃度下木耳菌絲體胞內多糖含量Fig.2 The intracellular polysaccharide contentof Auricularia auricular mycelia in different concentration of Ge

由圖2結合方差分析，鍺濃度對木耳菌絲體胞內多糖含量存在極顯著影響（p＜0.01），當鍺濃度為400μg/m L時，菌絲體中胞內多糖含量最多，達106.80mg/g，比空白對照提高16.56%。

2.3 鍺濃度對木耳菌絲體有機鍺含量的影響

由實驗得到鍺含量標準回歸方程為：y=0.065x+ 0.0037，R2=0.9826，根據標準方程計算得到不同鍺濃度培養條件下木耳菌絲體中有機鍺含量如圖3所示。

由圖3結合方差分析，鍺濃度對木耳菌絲體中有機鍺含量存在顯著影響（p＜0.05），當鍺濃度在800μg/m L時，菌絲體的有機鍺含量最多，達到8.67mg/g，比空白對照增加57.8倍。在本實驗中，培養基中鍺濃度越高，木耳菌絲體中有機鍺含量越多。

圖3 不同鍺濃度下木耳菌絲體中有機鍺含量Fig.3 The organic Ge contentof Auricularia auricular mycelia in different concentration of Ge

2.4 鍺濃度對木耳菌絲體蛋白質含量的影響

由實驗得到木耳菌絲體蛋白質標準回歸方程為：y=0.0078x+0.019，R2=0.9932，根據標準方程計算得不同鍺濃度培養條件下木耳菌絲體中蛋白質含量如圖4所示。

圖4 不同鍺濃度下木耳菌絲體蛋白質含量Fig.4 The protein contentof Auricularia auricular mycelia in different concentration of Ge

由圖4結合方差分析，鍺濃度對木耳菌絲體中蛋白質含量存在極顯著影響（p＜0.01），當鍺濃度為400μg/m L時菌絲體中蛋白質含量最多，達到117.52mg/g，比空白對照提高15.27%。

2.5 鍺濃度對木耳菌絲體中氨基酸含量的影響

由實驗得氨基酸含量標準回歸方程為：y= 0.1522x-0.0318，R2=0.9994，根據標準方程計算得到不同鍺濃度培養條件下木耳菌絲體中氨基酸含量如圖5所示。

圖5 不同鍺濃度下木耳菌絲體氨基酸含量Fig.5 The amino acids contentof Auricularia auricular mycelia in different concentration of Ge

由圖5結合方差分析，鍺濃度對木耳菌絲體中氨基酸含量存在極顯著影響（p＜0.01），當鍺濃度為600μg/m L時，木耳菌絲體中氨基酸的含量最多，達到82.18mg/g，比空白對照提高了11.58%。

2.6 鍺濃度對木耳菌絲體鳥苷含量的影響

由實驗得到鳥苷標準回歸方程為：y=0.0018x+ 0.0038，R2=0.9878，根據標準回歸方程得出不同鍺濃度培養條件下木耳菌絲體中鳥苷含量如圖6所示。

圖6 不同鍺濃度下木耳菌絲體鳥苷含量Fig.6 The guanosine content of Auricularia auricular mycelia in different concentration of Ge

由圖6結合方差分析，鍺濃度對木耳菌絲體中鳥苷含量存在極顯著影響（p＜0.01），當鍺濃度為400μg/m L時，菌絲體中鳥苷含量最多，達到10.59mg/g，比空白對照提高了49.58%。

2.7 鍺濃度對木耳菌絲體胞苷含量的影響

由實驗得出胞苷標準曲線為：y=0.0013x+0.0015，R2=0.9826，根據標準曲線計算得出不同鍺濃度培養條件下木耳菌絲體中胞苷含量如圖7所示。

圖7 不同鍺濃度下木耳菌絲體胞苷含量Fig.7 The cytidine contentof Auricularia auricular mycelia in different concentration of Ge

由圖7結合方差分析，鍺濃度對木耳菌絲體中胞苷含量存在顯著影響（p＜0.05），當鍺濃度為400μg/m L時，菌絲體中胞苷含量最多，達到11.65mg/g，比空白對照提高了29.36%。

3 討論

本實驗結果表明，在鍺濃度較低情況下，鍺可以促進木耳菌絲體的形成，提高菌絲體生物量，增加木耳菌絲體胞內多糖、蛋白質、氨基酸、鳥苷和胞苷含量；當鍺濃度較高時，對木耳菌絲體的形成有一定的抑制作用，使木耳菌絲體生物量、胞內多糖、蛋白質、氨基酸、鳥苷和胞苷含量減少。鍺是稀有元素，機體需求量甚微，在較低濃度時可能由于有機鍺參與了菌絲體的代謝活動，構成某些酶的組成部分，通過增加菌絲體的含氧量和清除一定的自由基，使菌絲體代謝活動增加，菌絲體的形成能力增強，從而提高了菌絲體生物量。有研究表明[21]，食藥用菌中的鍺可能是通過與多糖、蛋白質等相結合的形態存在，因此，通過食用菌的生物轉化作用，使無機鍺轉化為有機鍺，并增加了菌絲體的蛋白質和多糖等物質的含量。當鍺濃度過高時，由于菌絲體對鍺的需要量很微少，加之其具有一定的毒性使菌絲體的代謝受阻，菌絲體的形成能力減弱，降低了菌絲體的生物量、胞內多糖、蛋白質、氨基酸、鳥苷和胞苷等成分的含量。

在本實驗鍺濃度范圍內，木耳菌絲體中有機鍺含量隨著培養基中鍺濃度的升高而增加。這可能是由于培養基中鍺濃度的增加，使其轉化為有機鍺的底物含量增加了，提高了轉化效率所致。

4 結論

綜上所述，在木耳深層液體富鍺培養過程中，培養基中鍺濃度對木耳菌絲體主要化學成分含量有顯著影響，鍺濃度在適當范圍內可以增加木耳菌絲體生物量，胞內多糖、蛋白質、氨基酸、有機鍺、鳥苷、胞苷等幾種主要成分含量，當鍺濃度過高時對上述主要成分含量的形成有抑制作用。在鍺濃度實驗范圍內木耳菌絲體中有機鍺含量隨著鍺濃度的升高而增加。

[1]圖力古爾，李玉．我國側耳屬真菌的種類資源及其生態地理分布[J]．中國食用菌，2001，20（5）：8-10．

[2]畢志樹，鄭國揚，李泰輝，等．廣東大型真菌志[M]．廣東：廣東科教出版社，1994．

[3]楊月欣，王光亞，潘興昌，等．中國食物成分表[M]．北京：北京大學醫學出版社，2002．

[4]李玉．中國黑木耳[M].長春：長春出版社，2011．

[5]劉祖同，羅信昌．食用菌生物技術及應用[M]．北京：清華大學出版社，2002：166-172．

[6]秦俊法．必需微量元素的發現簡史及鍺的必需性問題[J]．廣東微量元素科學，1995，2（1）：1

[7]Munakata T，Agai S．Induction of interferon production by natural killer cells by organic germanium compound Ge-132[J]．Inteferon Res，1987，7（1）：69-76．

[8]Aso H．Induction of interferon and activation of NK cells and macrophages in mice by oral administration of Ge-132，an organic germanium compound[J]．Microbial Immunol，1985，29：65-74．

[9]陳石良，許正宏，陶文沂，等.灰樹花富鍺培養研究[J].無錫輕工大學學報，2000，19（3）：248-251.

[10]李秋蕊.富鍺羊肚菌菌絲體深層發酵的研究[D].長春：吉林大學，2005.

[11]魏紅，吳向陽，仰榴青，等．黑木耳多糖的提取工藝[J].食品研究與開發，2010，31（5）：109-111．

[12]陳宏偉，周冰斌，朱蘊蘭，等．蟲草深層培養產多糖條件的優化及多糖組分的研究[J]．徐州工程學院學報，2005，20（1）：78-83．

[13]尹計秋，燕小梅，牛奔．微波消解-火焰原子吸收光譜法測定海藻中的微量元素[J]．光譜實驗室，2011，28（1）：118-120．

[14]高平章，張英武，肖玲玲，等．微波消解-火焰原子吸收光譜法測定黃岑中的微量金屬元素含量[J]．安徽農業科學，2010，38（35）：2021-2022．

[15]李云，衷明華．微波消解-火焰原子吸收光譜法測定下火藥材中的微量元素[J]．光譜實驗室，2010，27（1）：257-259．

[16]劉瑛，楊秀華，盧中熱．石墨爐原子吸收光譜法測定飲料中的鍺及基體干擾的研究[J]．分析測試學報，1995，14（5）：49-52．

[17]強偉，王洪倫，周昌范，等．考馬斯亮藍G-250染色法測定檸條錦雞兒種子中可溶性蛋白含量[J].氨基酸和生物資源，2011，33（3）：74-76．

[18]黃松，吳月娜，劉梅，等．茚三酮比色法測定青天葵中總游離氨基酸的含量[J]．Chinese Journal of Informat ion on TCM，2010，12（17）：50-52．

[19]唐靜，周玲，田小瓊，等．茚三酮比色法測定野生及人工培養香菇和黑木耳中氨基酸含量[J].大理學院學報，2008，12（7）：6-8．

[20]王陶，李文，陳宏偉，等．蟲草素的微波-超聲波協同提取[J].食品科學，2010，31（10）：86-90．

[21]M I ZU NO T.Development and utilizat ion of bioactive substances from mushr oom fungi[J].Food and Development，1995，23（2）：41-45.

Main chem ical com positions analysis of Auricularia auricula germanium riched

ZHU Yun-lan
（Xuzhou Institute of Technology，Xuzhou 221111，China）

Auricularia auricular was used as thematerials and gotm ycelia Ge riched by using of submerged liquid cultivation in d ifferent concentration of Ge，through the determ ination ofm ycelia biological ind icators to find the effects of Ge concentration to the main com position of the Auricularia auricula.The result showed that as the Ge concentration was at 400μg/m L in the culuture med ium，m ycelia biomass，the contents of polysaccharide，p rotein，guanosine and cytid ine reached the peak，10.11，106.80，117.52，10.59，11.65mg/g，respectively.As com pared w ith the control b lank，the m ycelia biomass，the contents of polysaccharide，p rotein，guanosine and cytid ine increased by 10.86%，16.56%，15.27%，49.58%，29.36%，respectively.When Ge concentration was 600μg/m L，the contentof am ino acids reached the highest up to 82.18mg/g，when increased 11.58%com pared w ith the control b lank.When organic germanium concentration was 800μg/m L，organic germanium content reached 8.67mg/g，and it was 57.8 times of the correspond ing control.The content of organic germanium increased w ith the rise of the Ge concentration inc reases in the range of this testofGe concentration.The content of intracellular polysaccharide，am ino acid，p rotein，guanosine and cytidine of Auricularia auricular allalong w ith the rise of the Ge concentration on first increased and then decreased tendency.Ge could im p rove the content above the index when Ge concentration was low，and could inhibition the contentas Ge concentration was high.

Auricularia auricula；submerged liquid culture；germanium；chem ical compositions

TS201.3

A

1002-0306（2012）22-0234-05

2012－08－29

朱蘊蘭（1968-），女，講師，研究方向：應用微生物。