紅茂草生物堿提取工藝優選及色譜分析

王廷璞，李 強，劉小東，袁毅君

（1.天水師范學院生命科學與化學學院，甘肅天水 741001；

2.上海海洋大學水產種質資源發掘與利用教育部重點實驗室，上海 201306；

3.華中科技大學中英HUST-RRes基因工程與基因組學聯合實驗室，湖北武漢 430074）

紅茂草生物堿提取工藝優選及色譜分析

王廷璞1，李 強2，劉小東3，袁毅君1

（1.天水師范學院生命科學與化學學院，甘肅天水 741001；

2.上海海洋大學水產種質資源發掘與利用教育部重點實驗室，上海 201306；

3.華中科技大學中英HUST-RRes基因工程與基因組學聯合實驗室，湖北武漢 430074）

目地：優選紅茂草生物堿提取與干燥工藝，對提取物進行分析鑒定。方法：優選提取方法，利用L9（34）正交實驗優選紅茂草生物堿的提取影響因子，高效液相色譜層析分離鑒定主要成分，用真空冷凍干燥技術進行干燥保存。結果：提取方式優選超聲波提取法，L9（34）正交實驗得液料比30∶1、pH7、乙醇體積分數75%、溫度80℃為最佳的提取條件，平均得率可達4.215%，平均回收率和RSD分別為99.57%、0.68%，穩定性良好。異紫堇堿與原阿片堿含量顯著高于其他生物堿。結論：超聲波提取、真空冷凍干燥工藝適合于紅茂草生物堿的提取，異紫堇堿和原阿片堿的高效液相色譜鑒定可用于紅茂草生物堿制劑質量控制的指標。

紅茂草，生物堿，色譜分析

紅茂草（Dicranostigma leptopodum Maxim.），又名禿瘡花、禿子花、勒馬回（陜西），二年生或多年生草本，為罌粟科禿瘡花屬植物。主要分布在我國甘肅、陜西、河南、山西、青海、四川、云南、西藏等省區的低山丘陵地帶。在民間的紅茂草根或全草可入藥，有清熱解毒、消腫止痛、殺蟲等功效。主治扁桃體炎、牙痛、喉嚨痛、淋巴結核，外用于禿瘡、瘡癤疥癬、癰疽等癥[1]。紅茂草生物堿是從紅茂草全草中分離提取的有效成分，為多種喹啉類或異喹啉類生物堿；主要成分為紫堇堿、異紫堇堿、原阿片堿、異紫堇啡堿、木蘭堿5種生物堿，具有明顯的鎮痛、鎮靜、解除平滑肌痙攣等作用。近年來，研究發現其在抑菌、抗病毒、肝組織損傷保護和免疫調節等方面具有明顯的效果，且安全無毒副作用。研究結果證明，紅茂草是一種亟待開發的新藥物資源，具有廣闊的開發應用前景和巨大的社會經濟效益。生物堿具有明顯的生物學活性和藥理學活性，是紅茂草中的主要有效成分，其含量高低直接影響到藥材的質量與療效。國內對紅茂草進行了大量研究[2-4]，但對于紅茂草生物堿提取工藝、冷凍工藝[5]與高效液相色譜分離檢驗卻鮮有報道。故筆者希望能夠通過此實驗找到一種快速、靈敏、高效的提取與檢測紅茂草生物堿的方法，為工業化生產提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

原阿片堿標準品 Shanghai Tautd Biotech Co.，Ltd.，（China）公司，批號：E-0411，CASBO-86-9，規格：10mg；異紫堇堿標準品 ABCR Gmbh&Co.KG im Schlehert公司，批號：166401，規格：10mg；乙腈、三乙胺 色譜純；紅茂草生物堿對照品 由袁毅君教授提供，天水師范學院細胞工程室制備、保存，含量20mg/m L；其他試劑 均為分析純；紅茂草全草 甘肅省天水市規范化批量種植，陰干，制成粉末。

Agilent 1100 series高效液相色譜系統 安捷倫科技公司；紫外-可見分光光度計 日本；超聲波裂解儀 昆山市超聲儀器有限公司；旋轉蒸發器 上海青浦滬西儀器廠；真空冷凍干燥機 德國。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準曲線的制備 準確稱取生物堿對照品4mg于離心管中，加去離子水4m L制成濃度1mg/m L的對照液。測定時加去離子水稀釋至濃度分別為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06mg/m L。以去離子水為空白對照，在210nm波長處測吸光度得回歸方程A＝28.65x＋0.0246，R2＝0.9981，結果表明總生物堿在0～0.06mg/m L范圍內，呈良好的線性關系。

1.2.2 提取方法選擇 分別采用超聲波提取法、冷浸提取法、索氏提取法[6]按如下過程操作：紅茂草全草粉末10g→按1∶15加去離子水浸泡→分別于超聲波裂解儀（60℃、1h）、冷浸（過夜）、索氏回流（8次）處理→經高速離心（3500r/min）10min得上清液→取上清加95%乙醇至原溶液酒精度達80%→靜置過夜，常溫高速離心（3500r/min）10min，取上清液→50℃旋轉蒸發回收乙醇并濃縮至20mL→濃縮液-75℃冷凍過夜→真空冷凍干燥（-62℃，0.011MPa）24h得紅茂草生物堿制品，稱重→取各制品分別4mg溶于4mL去離子水中，6倍稀釋→過微孔濾膜 （0.22μm）→得吸光度A→將所測得A值代入標準曲線回歸方程，計算生物總堿含量→得生物總堿最佳提取方式。

1.2.3 影響因素的選擇 分別選取超聲時間、液料比、pH、乙醇體積分數、超聲溫度五因素進行單因素實驗，操作方法同1.2.2。

得率（%）=制品中粗生物總堿提取質量（m1）/紅茂草質量（m2）×100

1.2.4 正交實驗設計 根據有關文獻資料和預實驗[7]，結合單因素對紅茂草生物總堿得率的影響分析，選擇液料比、pH、乙醇體積分數、溫度4因素為指標進行L9（34）正交實驗，方法同1.2.2。通過正交實驗確定紅茂草生物總堿的最佳提取工藝。正交實驗設計見表1。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 Factors and levels in orthogonal array design

1.2.5 重現性實驗 取同一批紅茂草粉末6份，按正交優選的最佳提取條件進行重復性實驗三次，測定吸光度A值，計算含量，從而得到平均得率。在上述最佳提取條件下做重現性實驗，計算生物堿平均得率為4.215%。

1.2.6 加樣回收率實驗 取同一批已知含量（質量分數4.212%）的紅茂草真空冷凍產物6份，分別加入紅茂草對照品溶液適量，按正交最佳提取條件提取，測定吸光度A值，計算含量，得平均回收率與RSD。

1.2.7 數據處理 運用Origin 75軟件設計單因素考察圖；利用SPSS 11.5軟件對正交實驗進行設計及其數據分析。

1.3 異紫堇堿與原阿片堿的含量測定

1.3.1 色譜檢測波長的選擇 將異紫堇堿對照品配制成濃度為2μg/m L，以去離子水作為對照，利用UV-2450紫外-可見分光光度計在190～500nm波長范圍內掃描，即得異紫堇堿對照品的最大吸收波長；原阿片堿的最大吸收波長參考制品廠所提供以及相關文獻[8]。

1.3.2 標準品與供試品溶液的制備 分別取所購原阿片堿標準品與異紫堇堿標準品各10mg，加入0.22μm的微孔濾膜過濾的去離子水10m L，充分搖勻溶解配制成1mg/m L的標準母液，備用。

取各組分供試品50mg，加入50m L去離子水于50m L容量瓶中定容至刻度，充分搖勻溶解，配制成1mg/m L的供試液，先用濾紙過濾，再用0.2μm微孔濾膜過濾，即得供試液樣品。

1.3.3 色譜條件 異紫堇堿色譜條件：Zorbax eclipse XDB C8（150mm×4.6mm i.d）；流動相[9]：乙腈∶0.03mol/L NaH2PO4=26∶74；流速：1.0m L/m in；檢測波長：220nm；柱溫：30℃。

原阿片堿色譜條件：Zorbax ec：lipse XDB C8（150mm×4.6mm i.d）；流動相[10]：乙腈∶三乙胺-冰醋酸=18∶82（8m L三乙胺，50m L冰醋酸）；檢測波長：285nm；柱溫：25℃。

1.3.4 線性關系考察 原阿片堿標準曲線的制備：精密量取原阿片堿母液分別稀釋配制成濃度為0.00125、0.0025、0.01、0.02、0.03、0.055mg/m L的溶液，20μL進樣，測定獲取峰面積積分值作為縱坐標，同時以標準品質量濃度為橫坐標，得原阿片堿線性回歸方程。

異紫堇堿標準曲線的制備：方法同原阿片堿標準曲線的制備，得異紫堇堿線性回歸方程。

2 結果與分析

2.1 提取方法對總生物堿得率的影響

多重比較結果表明，分別利用超聲提取法、冷浸提取法、索氏提取法提取紅茂草中的生物總堿，超聲提取法對紅茂草中總生物堿的提取的影響效果顯著高于索氏提取法與冷浸提取法（p＜0.05）；冷浸提取法對紅茂草中生物總堿提取的影響效果極顯著于索氏提取法（p＜0.01）；而超聲波提取法所用提取時間相對較少，操作簡單，綜合考慮，提取方式優選超聲波提取法。

表2 不同提取方式對紅茂草生物總堿提取效果比較Table 2 Differentextractionmethods on comparison of alkaloids’extraction

2.2 不同因素對生物總堿得率的影響

2.2.1 不同超聲時間對紅茂草生物總堿的得率的影響 由圖1可知，不同超聲時間下紅茂草中生物總堿得率以0.5h最高，顯著高于其他組別（p＜0.05），1h與1.5h次之。多重比較結果表明，1h超聲對紅茂草中總生物堿得率極顯著高于1.5h的得率（p＜0.01）。

圖1 不同超聲時間對紅茂草生物總堿的得率的影響Fig.1 Effectof differentultrasonic time on the Dicranostigma leptopodum alkaloids’extraction ratio

2.2.2 不同液料比對紅茂草生物總堿的得率的影響

由圖2可知，實驗組液料比為30∶1時所提物中生物總堿的含量最高，料液比小于30∶1時，生物堿的得率隨液料比的增加而增加，因為隨著液料比的增加，細胞內外的濃度差逐漸變大，內擴散速度也增加，因此越有利于生物總堿的溶出。但是當液料比大于50∶1后，由于提取生物總堿時加入的溶劑量過大以至溶液被稀釋程度增大，此時生物總堿的得率逐漸降低。多重比較結果表明，液料比為20∶1、30∶1、40∶1（mg/m L）時對紅茂草生物堿得率相互之間差異顯著（p＜0.05）。

圖2 不同液料比對紅茂草生物總堿的得率的影響Fig.2 Effectof different liquid ratio on the Dicranostigma leptopodum alkaloids’extraction ratio

2.2.3 不同pH對紅茂草生物總堿的得率的影響 由圖3可知，不同pH對提取紅茂草中生物總堿的影響當pH 8時最大，對應得率最高。當pH＜8時，由于酸堿中和反應的影響，提取生物總堿的得率并不高；當pH＞8時，可以發現生物堿的得率開始減少，說明pH對紅茂草中總生物堿的影響已不再顯著。多重比較結果表明，pH 7對紅茂草中總生物堿得率的影響效果差異顯著于pH 6、pH 8的組份（p＜0.05），pH 8組份得率顯著高于pH6的（p＜0.05）。

圖3 不同pH對紅茂草生物總堿的得率的影響Fig.3 Effectof different pH on the Dicranostigma leptopodum alkaloids’extraction ratio

2.2.4 不同乙醇體積分數對紅茂草生物總堿的得率

由圖4可知，當乙醇體積分數為75%時，所對應的紅茂草生物總堿得率最大，即其含量最高。當乙醇體積分數小于75%時，隨著乙醇體積分數的不斷增加，其對應的生物總堿的得率不斷增加，即紅茂草中生物總堿含量不斷增加，但當乙醇體積分數大于75%時，其對應的生物總堿的含量隨著乙醇體積分數的不斷增加，呈現出相對減小的趨勢，原因可能是隨著乙醇體積分數不斷增大，使得所得濾液中溶入的雜質物質的增多造成的。多重比較結果表明，乙醇體積分數75%的紅茂草生物堿得率顯著高于乙醇體積分數65%、85%的組別（p＜0.05）。

圖4 不同乙醇體積分數對紅茂草生物總堿的得率的影響Fig.4 Effect of differentethanol concentration on the Dicranostigma leptopodum alkaloids’extraction ratio

2.2.5 不同溫度對紅茂草中生物總堿的得率的影響由圖5可知，溫度對紅茂草中生物總堿得率的影響表現為溫度越高，得率相應越高，但考慮到實際生產的需要，以80℃為標準。多重比較結果表明，溫度60、70、80℃對紅茂草中總生物堿得率彼此間差異均顯著（p＜0.05）。

2.3 正交實驗結果與分析

圖5 不同溫度對紅茂草中生物總堿的得率的影響Fig.5 Effect of different temperatures on the Dicranostigma leptopodum alkaloids’extraction ratio

表3 結果與分析Table 3 Results and analysis

表4 方差分析Table 4 Analysis of variance

B因素（即pH）對紅茂草中生物總堿提取的影響效果不顯著，因此將B因素作為方差分析時的誤差列。由表3可知，影響超聲波提取紅茂草生物總堿得率的影響因素依次為：液料比＞乙醇體積分數＞溫度＞pH。A因素（即液料比）對紅茂草中生物總堿提取的影響顯著強于其他因素，為正交實驗提取紅茂草中生物總堿的最主要因素。綜合考慮，紅茂草生物總堿最佳的提取條件為A2B1C2D3，即液料比30∶1、pH 7、乙醇體積分數75%、溫度80℃。

2.4 加樣回收率實驗

根據有關標準[11]可知，平均回收率在95%～105%之間為回收率良好，RSD（相對標準偏差）＜3%時，測定結果精密度良好，本實驗紅茂草生物總堿平均回收率與RSD分別為99.57%和0.68%，結果表明本實驗優化提取方法準確度良好，專屬性強，精密度良好。

表5 回收率測定表（n=6）Table 5 Table of recovery rate（n=6）

2.5 異紫堇堿與原阿片堿的含量測定結果與分析

2.5.1 色譜檢測波長的選擇結果與分析 掃描圖譜顯示，異紫堇堿在220nm波長處有最大吸收，其吸收值為0.238；原阿片堿最大吸收波長選擇285nm檢測。

圖6 異紫堇堿的最大吸收波長Fig.6 Maximum absorption wavelength of isocorydine

2.5.2 線性關系考察 原阿片堿線性回歸方程為A＝14453x－17.966，R2＝0.9906。結果表明，紅茂草樣品生物總堿中原阿片堿的質量濃度在0.00125～0.055mg·m L－1的范圍內具有良好的線性關系；異紫堇堿線性回歸方程為A＝112649x－7.9518，R2＝0.9944。結果表明，紅茂草樣品生物總堿中異紫堇堿的質量濃度在0.002～0.025mg·m L－1的范圍內具有良好的線性關系。

2.5.3 樣品的鑒定結果與分析 圖HPLC結果分析表明，異紫堇堿標品（濃度為0.1mg/m L）的保留時間為5.410m in（圖A），吸收峰面積為10631.7，紅茂草生物總堿樣品在5.443m in有明顯吸收峰（圖B），吸收峰面積為1632.1。因此可知，樣品中異紫堇堿含量為15.35%；同理，原阿片堿標品（濃度為0.1mg/m L）的保留時間13.386m in（圖C），吸收峰面積為1610，紅茂草生物總堿樣品在13.373m in（圖D）也出現顯著特異峰，吸收峰面積為91.7。因此可知，樣品中原阿片堿的含量為5.70%。但同時在HPLC過程中可以看出在保留時間2.940m in與2.111m in左右，樣品中有明顯高的不明吸收峰，有待進一步深入探究。

圖7 對照品HPLCFig.7 HPLC of reference substance

圖8 異紫堇堿標準品HPLC（A）、正交實驗所得異紫堇堿樣品HPLC（B）、原阿片堿標準品HPLC（C）、正交實驗所得原阿片堿樣品HPLC（D）Fig.8 HPLC of standard isocorydine（A），sample of isocorydine from orthogonal experiment（B），HPLC of original protopine（C），sample of original protopine from orthogonal experiment（D）

3 結論

3.1 傳統方法提取工藝繁雜、耗時、得率低、重現性差。本實驗著手于提取工藝優化與主要成分的鑒定，正交實驗所得結果提取得率高、重現性好，工藝穩定簡便，很適合工業化生產。平均得率可達4.215%，平均加樣回收率為99.57%，RSD為0.68%。

3.2 高效液相色譜法測定紅茂草總生物堿中異紫堇堿與原阿片堿含量，專屬性強、結果明顯、準確可靠、實用性強、分離度良好、穩定、操作簡便，可以作為中藥紅茂草中異紫堇堿與原阿片堿的鑒定方法。

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Extraction methods and chromatographic analysis of Dicranostigma leptopodum alkaloids

WANG Ting-pu1，LIQiang2，LIU Xiao-dong3，YUAN Yi-jun1
（1.College of Life Science and Chemistry，Tianshui Normal University，Tianshui741001，China；
2.Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources，Ministry of Education，ShanghaiOcean University，Shanghai201306，China；
3.China-UK HUST-RRes Genetics Engineering and Genomics Joint Laboratory，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430074，China）

Ob jective：To get the alkaloids’op tim ization of p rocess of Dicranostigma lep topodum，detach and identify the extracts and d ry storage.Methods：First the methods of extrac ting were choosen，then impact fac tors were selected by the L9（34）orthogonal experiment，which was combined w ith high performance liquid chromatog raphy，and the vacuum freeze-d rying technology was used to store.Results：The op timal extraction means was ultrasonic wave extraction，and L9（34）orthogonal best extraction cond itions was liquid ratio 30∶1，pH7，75%ethanol volume frac tion and temperature 80℃.The average yield was 4.215%.The average recovery and RSD were 99.57%and 0.68%，with good stability.The content of p rotopine and Isocoryd ine were higher than other alkaloids.Conc lusion：The technology of ultrasonic wave extraction，vacuum freeze-d rying and HPLC were app lied to extract，d ry and separating inspection.The result was suitab le for its extraction and identification.

Dicranostigma lep topodum；alkaloids；chromatog raphic analysis

TS297

A

1002-0306（2012）22-0051-05

2012－06－13

王廷璞（1965-），男，研究員，主要從事分子生物學研究。

甘肅省中醫藥管理局基金項目（GZK-2010-20）；2009年出國留學人員基金。