他克莫司對大鼠腎缺血再灌注保護作用的研究

武 飛 劉致中

(1.烏蘭察布市中心醫(yī)院泌尿外科，烏蘭察布 012000;2.內(nèi)蒙古醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院泌尿外科，包頭 014000)

缺血再灌注損傷是腎臟移植中不可避免的病理過程，輕者導致腎功能延遲恢復，重者造成腎功能衰竭，影響移植腎和患者的長期存活。如何減輕腎移植過程中的缺血再灌注損傷是一個重要的研究領(lǐng)域。目前雖然有多種藥物和治療手段運用于改善腎缺血再灌注損傷，但是缺乏特異性。有研究者發(fā)現(xiàn)［1］一些新型免疫抑制藥物在使用過程中，具有改善腎缺血再灌注損傷的特性，而且能夠使損傷后的腎臟得到一定程度的修復和再生。他克莫司是目前用于器官移植后抗排異反應的新型免疫抑制藥物。為了證實他克莫司改善腎臟缺血再灌注損傷的作用。本實驗建立大鼠缺血再灌注模型，研究他克莫司對大鼠腎缺血再灌注的保護作用。

1 材料與方法

1.1 試劑

大鼠TNF-α試劑盒(ELISA)(美國);Bcl-2蛋白單克隆抗體(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司);SP免疫組化試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司);他克莫司注射液(由藤澤制藥有限公司惠贈)。

1.2 實驗動物及分組

選用健康雄性Wistar大鼠60只(購自內(nèi)蒙古大學動物實驗中心)，體質(zhì)量220～260 g。采用抽簽法隨機分成3組(每組20只):假手術(shù)組、對照組、實驗組。每組按再灌注時間分為4組，再灌注分別為0.5、2、6、24 h，每組5 只。

1.3 動物模型建立

所有動物實驗前禁食12 h，自由飲水，對大鼠注射20%烏拉坦(5 mL/kg)行腹腔麻醉后，沿腹部正中切口進腹，切除右腎，分離左腎動脈，用無創(chuàng)動脈夾夾閉左腎動脈，45 min后移走無創(chuàng)動脈夾恢復灌注，腎臟由暗紅色變?yōu)轷r紅色，表明再灌注成功，縫合切口。假手術(shù)組僅作麻醉、開腹、行右腎切除術(shù)，并分離左腎動脈，不阻斷腎動脈血供，只做操作而不給藥。對照組建立腎缺血再灌注模型，于手術(shù)前6 h從尾靜脈注射0.9%氯化鈉注射液1 mL/kg。實驗組建立腎缺血再灌注模型，于手術(shù)前6 h從尾靜脈注射0.2 g/L的他克莫司注射液(0.5 mg/kg)。每組在到達再灌注時間點分別再次麻醉，打開腹腔取血及腎臟標本，整個手術(shù)過程均保持無菌操作。

1.4 觀察指標

肌酣(creatinine，Cr)、尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)用全自動生化分析儀測定。將組織進行HE染色后用光學顯微鏡觀察腎組織形態(tài)學變化。用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)測血清腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)含量。用免疫組化技術(shù)測定腎組織Bcl-2蛋白，其陽性結(jié)果判定:Bcl－2陽性反應結(jié)果為胞質(zhì)內(nèi)呈棕黃色染色，不著色者為陰性。在高倍鏡下(400×)，每片隨機取5個視野，每個視野計100個細胞，計算陽性細胞數(shù)，陽性細胞數(shù)為0，記作(－)，陽性細胞數(shù)25%以下為(+)，25% ～50%為(++)，51% ～75% 為(+++)，75% 以上為(++++)，并將反應強度評分，“+”為1分，“++”為2分，“+++”為3分，“++++”為4分［2］。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 10.0統(tǒng)計分析軟件進行分析，所得實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同時間點兩組大鼠Cr、BUN的變化

對照組大鼠在腎缺血再灌注的0.5 h、2 h、6 h及24 h，隨著再灌注時間的延長，Cr、BUN明顯升高。實驗組大鼠在腎缺血再灌注的0.5 h、2 h及6 h，隨著再灌注時間的延長，Cr、BUN升高不明顯，而在再灌注24 h時，Cr、BUN不再升高，反而明顯降低。在腎缺血再灌注2 h、6 h和24 h時，實驗組和對照組的 Cr、BUN差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，詳見表1。

表1 3組大鼠各再灌注時間點的Cr、BUN比較Tab.1 Comparison of the Cr and BUN among three groups(±s)μmol/L

表1 3組大鼠各再灌注時間點的Cr、BUN比較Tab.1 Comparison of the Cr and BUN among three groups(±s)μmol/L

* P ＜0.05 vs sham operation group;△ P＜0.05 vs control group;Cr:creatinine;BUN:blood urea nitrogen.

Group Number of case Cr 0.5 h 2 h 6 h 24 h Sham operation group 20 30.50 ±5.31 33.76 ±7.12 39.44 ±7.46 43.32 ±8.61 Control group 20 50.90 ±7.09 76.08 ±4.59 98.38 ±11.43* 156.18 ±64.25*Experimental group 20 53.38 ±2.39* 60.62 ±2.88＊△ 75.10 ±17.28＊△ 51.30 ±6.47△Group Number of case BUN 0.5 h 2 h 6 h 24 h Sham operation group 20 8.76 ±1.46 10.34 ±2.2115.65 ±3.75 14.42 ±3.68 Control group 20 13.38 ±2.00 20.33 ±1.98* 26.21 ±3.28* 44.26 ±3.15 Experimental group 20 12.16 ±0.95* 14.75 ±0.63△ 19.72 ±2.44＊△ 15.29 ±3.39△

2.2 血清TNF-α 的變化

對照組在再灌注各時間點隨著再灌注時間的延長，TNF-α含量明顯的升高。實驗組在再灌注0.5 h、2 h及6 h，隨著再灌注時間的延長，TNF-α含量升高不明顯，而在再灌注24 h時，TNF-α含量出現(xiàn)了降低。在再灌注的各時間點，實驗組和對照組TNF-α含量差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，詳見表2。

2.3 免疫組化檢測腎組織Bcl-2的表達

各組大鼠腎組織中均有Bcl-2表達，主要在腎的遠曲小管、近曲小管表達，但免疫反應強度不同(圖1)。實驗組和對照組在再灌注2 h、6 h、24 h的Bcl-2免疫反應強度差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。假手術(shù)組的Bcl-2免疫反應強度在2 h、6 h與實驗組和對照組的差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，詳見表3。

表2 3組大鼠各再灌注時間點的TNF-α比較Tab.2 Comparison of the TNF-α among three groups(±s)pg/mL

表2 3組大鼠各再灌注時間點的TNF-α比較Tab.2 Comparison of the TNF-α among three groups(±s)pg/mL

* P ＜0.05 vs sham operation group;△ P ＜0.05 vs Control group;TNF:tumor necrosis factor.

Group Number of case 0.5 h 2 h 6 h 24 h Sham operation group 20 1.51 ±0.69 1.62 ±0.49 1.86 ±0.79 2.31 ±1.07 Control group 20 4.81 ±1.25 5.02 ±1.47 7.94 ±2.22 15.16 ±3.65 Experimental group 20 1.95 ±0.73＊△ 3.04 ±0.48＊△ 3.94 ±2.39△ 3.31 ±1.64＊△

圖1 各組大鼠腎組織缺血再灌注24 h Bcl-2蛋白表達Fig.1 Bcl-2 protein expression of the kidney in ischemia reperfusion 24 h of three group(400×)A:Control group;B:experimental group;C:shame operation group.

表3 3組大鼠各再灌注時間點的Bcl-2反應強度比較Tab.3 Comparison of the Bcl-2 among three groups(±s)

表3 3組大鼠各再灌注時間點的Bcl-2反應強度比較Tab.3 Comparison of the Bcl-2 among three groups(±s)

* P ＜0.05 vs sham operation group;△ P ＜0.05 vs control group;Bcl:B cell lymphoma.

Group Number of case 0.5 h 2 h 6 h 24 h Sham operation group 20 3.00 ±0.71 3.60 ±0.55 2.60 ±0.55 2.20 ±0.45 Control group 20 2.20 ±0.45 1.80 ±0.45* 1.20 ±0.45* 1.40 ±0.55 Experimental group 20 2.60 ±0.55 2.60 ±0.55＊△ 2.00 ±0.00＊△ 3.20 ±0.84＊△

2.4 腎組織的病理變化

在光鏡下，對照組在再灌注各時間點均出現(xiàn)腎小管擴張，腎小管上皮細胞明顯腫脹、空泡變性，間質(zhì)血管擴張充血，而在再灌注的6 h、24 h可見腎小管上皮細胞扁平、脫落，基底膜裸露。實驗組在再灌注的各時間點，腎小管及腎小管上皮細胞病變程度較對照組明顯減輕，而假手術(shù)組未見明顯改變(圖2)。

圖2 兩組大鼠腎組織缺血再灌注24 h病理變化Fig.2 Changes of histopathology in the ischemia reperfusion 24 h of the two group(400×)

3 討論

腎臟是對缺血再灌注損傷非常敏感的器官之一，其損傷機制十分復雜，與氧自由基所致的脂質(zhì)過氧化損傷、腎血管內(nèi)皮細胞生成和釋放的舒張與收縮因子失調(diào)等因素有關(guān)［3］。目前有多種藥物和治療手段運用于改善腎缺血再灌注損傷，他克莫司是新型免疫抑制藥物，在使用中發(fā)現(xiàn)具有改善缺血再灌注損傷的特性。他克莫司是一個鈣調(diào)磷蛋白磷酸酶抑制劑，可與T細胞胞質(zhì)內(nèi)的鈣離子-鈣調(diào)蛋白依賴性磷酯酶活性蛋白結(jié)合，阻斷磷酯酶活性和鈣離子內(nèi)流，使NF-AT途徑轉(zhuǎn)錄IL-2失活，從而抑制T細胞的活化，并可通過下調(diào)FAS和上調(diào)Bcl-2使移植肝臟產(chǎn)生抗凋亡作用［4］。趙偉等［5］通過他克莫司藥液對離體腎臟的浸泡研究，發(fā)現(xiàn)通過Bcl-2蛋白、Bcl-2 mRNA的表達增加，抑制腎細胞的凋亡，對離體腎起到保護作用。有文獻［6］報道，他克莫司可通過減少多種細胞因子如TNF-α、IL-1和自由基的生成;通過降低中性粒細胞的聚集和細胞黏附分子的合成來減輕缺血再灌注損傷，這種保護作用已在多種臟器中得到證實。

本文是通過活體注射他克莫司，然后建立腎缺血再灌注損傷模型，實驗結(jié)果顯示Bcl-2蛋白主要在腎的遠曲小管、近曲小管表達，通過增加Bcl-2蛋白的表達來抑制腎細胞的凋亡，保護腎細胞缺血再灌注損傷，也證明了在腎臟組織缺血之前給予他克莫司能夠降低TNF-α的濃度，從而減輕腎臟的缺血再灌注損傷。本實驗結(jié)果也顯示，在腎臟缺血前6 h給予他克莫司藥物，行腎缺血再灌注，在再灌注的時間段里，發(fā)現(xiàn)在再灌注的24 h腎小管，腎小管上皮細胞病變程度減輕明顯，腎組織中Bcl-2表達明顯增加，腎功能明顯改善。

王東等［7］在脂肪肝供體大鼠肝移植模型中觀察到，使用他克莫司可降低移植物脂質(zhì)過氧化程度，保護肝細胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)，對脂肪肝供體移植物功能具有保護作用。因此根據(jù)本實驗結(jié)果預測:在活體腎移植中，供腎者手術(shù)前6 h口服他克莫司，減輕腎缺血再灌注損傷，取出的腎植于受者，有利于受者腎功能恢復。為了移植腎術(shù)后早期功能的恢復，已有多種藥物和治療手段來減輕腎缺血再灌注損傷，因此對腎缺血再灌注損傷的防治還需更深入的研究。

［1］Garcia-Criado FJ，Lozano-Sanchez F，F(xiàn)ernandez-Regalado J，et al.Possible tacrolimus action mechanisms in its protector effects on ischemia-reperfusion injury［J］.Transplantation，1998，66(7):942-943.

［2］石群立，張?zhí)┖停X澄源，等.原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤Bcl-2蛋白的表達［J］.中華病理學雜志，1996，25(3):171.

［3］Kowaltowski A J，Smaili S S，Russell J T，et al.Elevation of resting mitochondrial membrane potential of neural cells by cyclosporin A BAPTA-Am and bcl-2［J］.Am J Physiol Cell Physio1，2000，279(3):852-859.

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［5］趙偉，王衛(wèi)國，邵鼓，等.FK506對大鼠離體腎細胞凋亡及bcl-2蛋白、bcl-2 mRNA表達的影響［J］.中華實驗外科雜志，2006，23(4):596-597.

［6］Laurens M，Scozzari G，Patrono D，et al.Warm ischemiareperfusion injury is decreased by tacrolimus in steatotic rat liver［J］.Liver transpl，2006，12(2):217-225.

［7］王東，朱繼業(yè)，栗光明，等.他克莫司對脂肪肝供體大鼠肝移植圍手術(shù)期移植物功能保護作用的研究［J］.器官移植，2010，1(1):11-12.