諾如病毒性胃腸炎快速檢測方法的研究

呂 虹 高志勇 張國軍 閆惠平 康熙雄*

(1.首都醫科大學附屬北京天壇醫院實驗診斷中心，100050;2.北京市疾病預防控制中心傳染病與地方病防治所，北京 100013;3.首都醫科大學附屬北京佑安醫院感染與免疫中心，北京 100069)

人類杯狀病毒(human caliciviruses，HuCV)包括諾如病毒(norovirus，NVs)和札如病毒(sapovirus，SVs)，是導致人類急性非細菌性胃腸炎的常見病原體，也是僅次于輪狀病毒導致兒童急性腹瀉的重要病原體。長期以來，由于檢測方法的局限，對HuCV給人類造成的危害及其嚴重程度缺乏正確的認識，常常低估其危害。1992年以美籍學者Jiang X［1］為首的研究組建立并發展了RT-PCR方法檢測HuCV后，HuCV所致疾病的危害性和嚴重性越來越被研究者重視。有效的RT-PCR檢測的關鍵是找到可以用于RT-PCR擴增的保守引物序列，并保證檢測的敏感性和特異性，目前，用于HuCV檢測的RT-PCR引物序列主要針對RNA多聚酶基因。由于HuCV病毒在糞便標本中的含量較低，需要建立更敏感、更特異的檢測方法。同時傳統的RT-PCR方法操作繁瑣，對實驗室和操作人員要求較高，容易引起結果假陽性或假陰性，給疾病診斷帶來困難。因此本研究建立了一種檢測NVs的新方法，并以傳統RT-PCR方法為標準對新方法進行評價，為NVs的檢測提供一種快速靈敏的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1)標本來源:選取2007年2月至2007年3月北京市36家醫療機構(二級以上醫院和區、市疾病預防控制中心)門診就診或住院的腹瀉患者364例，其中男性患者 202例，女性患者 162例，男女性別比1.25∶1。患者年齡從 ＜1歲至 79 歲，平均年齡(37.22±19.84)歲。診斷標準依據《諾如病毒感染性腹瀉防治方案(試行)》［2］，患者均有腹瀉或嘔吐等臨床癥狀，每日排便次數≥3次，糞便性狀發生明顯改變(稀水樣、蛋花樣、黏液便或稀便等，無膿血)，糞便、血常規檢查無特殊發現，顯微鏡檢查排除常見細菌、寄生蟲等感染，懷疑病毒性胃腸炎。

2)收集方法:樣本采集便盒由北京市疾病預防控制中心統一發放，無菌采便盒外包裹一層可開啟的塑料袋。樣本均為發病3 d內患者的糞便樣本，每份標本量不少于5 mL，不得用肛拭子采集，標本采集后要求立即低溫送檢，不能及時送檢的要求－20℃冰凍保存，標本避免反復凍融。長期保存樣本置于－80℃冰箱。

3)試劑來源:恒溫快速檢測諾如病毒試劑盒由日本東曹公司提供，諾如病毒提取試劑采用美國QIAGEN公司病毒核酸提取試劑盒(QIAamp?Viral RNA Mini Kit)，反轉錄體系采用Promega公司RNA反轉錄試劑盒。

4)引物:擴增區域位于諾如病毒基因組ORF1，基因位點在nt 4 568～4 886之間(參考株序列號為M87661)。由北京市中國疾病預防控制中心提供［3］，見表1。

表1 RT-PCR所用引物Tab.1 Primers used in RT-PCR

5)儀器設備:恒溫擴增系統由日本東曹公司提供，BIO-RAD擴增儀，Eppendorf高速低溫離心機，電泳儀，凝膠成像系統等。

1.2 方法

1)樣本處理:糞便樣本從－80℃冰箱取出，室溫復融。將1 mL樣本稀釋液(來自DAKO公司諾如病毒ELISA 試劑盒)至1.5 mL Eppendorf管中，加入0.1 g固體糞便樣本或0.1 mL液體糞便樣本，置于漩渦振蕩器上混勻，室溫靜置10 min，室溫下5 500 r/min離心5 min，進行檢測。

2)病毒RNA提取:病毒RNA提取采用美國QIAGEN公司病毒提取試劑盒。

3)反轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR):采用 Promega公司RNA反轉錄試劑盒，反應體系:10×緩沖液2.5 μL，25 mmol/L MgCl24 μL，2.5 mmol/L dNTPs 5 μL，1%BSA 2.5 μL，0.2 μg/μL 引物 289 混合液 1 μL，10 U/μL AMV-RT 0.35 μL，50 U/μL RNase 0.1 μL，DEPC 處理 H2O 8.05 μL，模板 RNA 1.5 μL，總體積25 μL。輕微離心混勻，42℃反轉錄1 h。PCR反應體系:10 × 緩沖液 5 μL，25 mmol/L MgCl24 μL，10 mmol/L dNTPs 1 μL，0.2 μg/μL 引物 289 混合液 1 μL，0.1 μug/μL 引物 290 混合液 1 μL，5 U/μL Taq酶0.4 μL，DEPC 處理 H2O 29.6 μL，cDNA 8 μL，總反應體積50 μL。輕微離心混勻，放入PCR儀中進行擴增。反應條件:94℃變性3 min，94℃ 1 min，58℃ 80 s，72℃ 1 min，循環30次，最后72℃延伸10 min。擴增產物用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

4)恒溫快速檢測方法:將試劑從－20℃冰箱取出，室溫復融。分別取10 μL試劑A和10 μL試劑B于0.5 mL PCR擴增管中，再加入5 μL模板RNA，每批次反應加陽性對照和陰性對照。將反應體系放入恒溫擴增系統中，43℃預熱5 min，同時將混合酶預熱3 min，將5 μL酶依次加入反應體系中，進行檢測。儀器通過1.3倍閾值判斷陰陽性結果。

1.3 統計學方法

用SPSS 11.5統計學軟件分析結果，計數資料以百分比表示，采用χ2檢驗，一致性分析采用Kappa系數，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 應用TRC方法對病毒性胃腸炎患者進行NVs核酸檢測的結果

TRC方法檢測諾如病毒，可以同時檢測NVs GGI型和NVs GGⅡ型，364例病毒性胃腸炎患者糞便樣本應用TRC方法進行檢測(表2)，NVs GGI型陽性14例，占總檢測病例的3.85%(14/364)，陰性350例，占總檢測病例的96.15%(350/364);NVs GGⅡ型陽性146例，占總檢測病例的40.11%(146/364)，陰性218例，占總檢測病例的59.89%(218/364)。

表2 不同型別諾如病毒應用TRC方法檢出情況Tab.2 Different types of norovirus detection using TRC method

應用TRC方法對病毒性胃腸炎患者糞便樣本進行檢測，NVs陽性總數為160例，占總檢測病例的43.96%(160/364)。其中 NVs GGI占 8.75%(14/160)，NVs GGⅡ占91.25%(146/160)。

應用TRC方法進行諾如病毒檢測，可以通過實時檢測熒光檢測信號觀察結果，檢測陽性曲線如圖1所示。在146例諾如病毒2型陽性的結果中，陽性結果檢出時間顯示89.73%的結果小于20 min，在14例諾如病毒1型陽性的結果中，陽性結果檢出時間顯示78.58%的結果小于20 min。

恒溫檢測方法共檢測出陽性數為160例，檢測陽性率為43.96%(160/364)。其中男性患者檢出率為45.54%(92/202)，女性患者檢出率為 41.76%(68/162)，兩組差異無統計學意義(χ2=0.465，P=0.495)。364例腹瀉病人樣本按年齡分組(表3)，其中陽性率最高的為50歲 ～59歲組，其陽性率為63.63%(35/55)，陽性率最低的為10～19歲組，其陽性率為18.93%(5/26)，通過χ2檢驗，除10～19歲組檢出率低于各組外，其余各組間檢驗結果差異無統計學意義(χ2=11.704，P=0.069)。

表3 364例腹瀉患者NVs檢測結果Tab.3 Test results of norovirus determination in 364 sporadic cases of acute viral gastroenteritis

2.2 TRC方法與RT-PCR方法檢測病毒性腹瀉患者糞便樣本中的核酸結果比較

RT-PCR方法檢出結果同TRC方法進行比較(表4)，兩種方法檢測雙陽性為139例，雙陰性為191例，另外有34份樣本兩種方法檢測結果不一致，其中TRC檢測方法陽性但是RT-PCR檢測方法結果陰性有21份，用RT-PCR方法檢測陽性而TRC方法檢測陰性的為13份。

以RT-PCR為標準，計算TRC方法的敏感度、特異性等指標如下:

敏感度Se=a/(a+c)=139/(139+13)=91.45%;

圖1 諾如病毒檢測陽性曲線Fig.1 Positive curve for detection of norovirus NVs:norovirus.

表4 TRC方法與RT-PCR方法的檢測結果Tab.4 Test results of TRC and RT-PCR

特異度Sp=d/(b+d)=191/(21+191)=90.09%;

總的符合率π=(a+d)/(a+b+c+d)=(139+191)/(139+21+13+191)=90.66%;

比數積OP=Se/(1－Se)*Sp/(1－Sp)=ad/bc=139*191/21*13=97.25;

陽性預測值PV+=a/(a+b)=139/(139+21)=86.88%;

陰性預測值PV－=d/(c+d)=191/(13+191)=93.63%。

這兩組檢驗結果經過配對χ2檢驗，P=0.229，說明兩組陽性檢出率之間的差異無統計學意義，即兩種實驗方法結果無差異。通過一致性檢驗結果顯示Kappa=0.809，P=0.000，可見這兩種試驗方法結果一致性極佳。

3 討論

NVs屬于HuCV科中諾如病毒屬，病毒直徑約為26～35 nm，無包膜，表面粗糙，球形，呈二十面體對稱;NVs基因組是單股正鏈RNA，全長約7 642 nt。諾如病毒家族成員龐雜，目前已對其100多個分離株進行基因測序。核酸的同源性分析表明，世界不同地區、不同時間流行的諾如病毒基因RNA多聚酶區序列相對保守，核苷酸氨基酸序列同源性高于60%，有的達到90%以上。因此，根據 RNA多聚酶區核苷酸序列的相似性，將諾如病毒分為5個遺傳組(genogroups，GG)，其中感染人的包括 GGⅠ、Ⅱ和Ⅳ。GGⅠ組也可感染豬，GGⅢ和GGⅤ組分別感染牛和鼠。NVs除了分5個遺傳組外還分29個基因型，其中GGⅠ組有8個，GGⅡ組有17個，GGⅢ組2個，GGⅣ組有1個，GGⅤ組有1個。其中GGⅡ/4型是傳播最廣的基因型，中國以及世界上絕大多數胃腸炎的暴發疫情都是由GGⅡ/4型引起的［4-6］。由于NVs不能進行體外培養，也沒有合適的動物模型，因此對其研究受到制約，檢測方法的進展研究緩慢。目前用于檢測該病毒的方法主要有電鏡法、免疫學檢測和分子檢測等，這些檢測方法是分別基于病毒外形特點、主要抗原決定簇和特異性核酸序列而建立的。1972年美國科學家Kapikian A Z等［7］就是通過免疫電鏡的方法發現NVs，因此該方法在很長一段時間內成為檢測NVs的經典方法。此方法對操作者的技能和經驗要求很高，沒有得到廣泛的推廣。RT-PCR方法特異性好、靈敏度高，能檢測到10～40拷貝的病毒核酸。20世紀90年代以來，研究者們分別成功地運用RT-PCR的方法對感染者糞樣中的NVs核酸進行了檢測，設計引物對RNA多聚酶基因相對保守的區域進行擴增，獲得了較高的陽性率。直至今日，RT-PCR方法仍是檢測NVs的常用方法。本研究中RT-PCR方法所用引物為針對HuCV RNA多聚酶區而設計的P289/P290混合引物，此方法檢出率高［8-11］，對于NVs的擴增產物為319 bp，SVs的擴增產物為331 bp，2者由于片段大小接近，很難用瓊脂糖凝膠電泳區分，需通過測序分析鑒定。

本研究所采用的TRC方法是一種帶熒光標記的實時監控恒溫擴增方法，引物設計位于 ORF1和ORF2的交界區。在43℃條件下，利用INAF熒光探針對目標RNA進行實時監測。應用TRC方法檢測病毒性胃腸炎患者糞便樣本中NVs核酸檢出率為43.96%(160/364)，略高于 RT-PCR 方法(41.76%)。以RT-PCR方法為標準，TRC方法，敏感度91.45%，特異度90.09%，總的符合率為90.66%，陽性預測值86.88%，陰性預測值93.63%。通過配對 χ2檢驗和Kappa檢驗，兩種方法結果之間差異無統計學，一致性極佳。

此外，TRC方法可以同時檢測NVs GGI和NVs GGⅡ，無需經過克隆測序分型，快速、簡便、靈敏、經濟，適合臨床和疾控部門推廣使用。

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