草莓灰霉病拮抗酵母菌的篩選鑒定及對采后草莓品質的影響

秦曉杰，許皎姣，索 娜，周海蓮，何 洋，肖紅梅

(南京農業大學食品科技學院，江蘇南京 210095)

草莓灰霉病拮抗酵母菌的篩選鑒定及對采后草莓品質的影響

秦曉杰，許皎姣，索 娜，周海蓮，何 洋，肖紅梅*

(南京農業大學食品科技學院，江蘇南京 210095)

從南京市馬群草莓生產基地的草莓果實、葉片上分離篩選到一株對灰霉病具有明顯抑制效果的拮抗酵母菌N1，結合生理生化特性及26S rDNA D1/D2區序列分析鑒定其為季也蒙畢赤酵母(Pichia guilliermondii)。通過用不同濃度N1菌懸液處理打孔后的草莓，發現菌懸液濃度越高，抑制效果越好，最佳濃度為5×108CFU/mL，其病斑直徑比對照組小了32.3%。拮抗菌N1處理后果實于(2±1)℃、相對濕度(RH)90%～95%下冷藏，結果表明，拮抗酵母N1菌對果實酸含量無顯著影響，但能保持草莓果實的光澤和硬度，維持VC含量和可溶性固形物含量，并顯著減小了失重率，提高了草莓的冷藏品質，從而顯著延長草莓的貯藏壽命。由此推測，該拮抗酵母菌具有很好的商業應用前景。

草莓，生物防治，季也蒙畢赤酵母，灰葡萄孢

草莓營養豐富，素有“水果皇后”之稱，但由于其組織嬌嫩多汁，果皮很薄，因而在采收和貯運中易受到損傷和微生物侵染導致其腐爛變質［1］。其中由灰葡萄孢引起的灰霉病為草莓生產中最主要的病害之一［2］，嚴重時可使草莓采后損失達50%以上，這直接影響了生產者的利益，也限制了草莓的進一步發展。長期以來，控制草莓采后病害最有效的方法仍然是使用化學殺菌劑，然而，隨著抗藥性和農藥殘留［3］等問題的出現以及人們對環保意識的增強，利用拮抗微生物來控制草莓采后病害在世界各地日益普及。目前已經分離出許多具有拮抗作用的細菌、放線菌和酵母菌，而許多研究表明酵母菌是一種理想的生防制劑［4］，因為它具有能夠附生在植物上面，對植物和人類沒有致病性且能迅速增殖、遺傳穩定、有較強抗逆性等優點，更容易被人們所廣泛接受。如檸檬形克勒克氏酵母(Kloeckera apiculata)對柑橘的指狀青霉(Penicillium digitatum)以及草莓和葡萄的灰葡萄孢(Botrytis cinerea)引起的腐爛［5－6］具有明顯的防效;異常畢赤酵母(Pichia anomala)和橄欖假絲酵母(Candida oleophila)對香蕉的冠腐?。?］及蘋果的灰霉?。?］生防效果較佳;膜醭畢赤酵母 (Pichia membranaefaciens)可防治桃子的褐腐?。?］等。為了更好的利用微生物資源進行果蔬采后病害防治，本實驗從草莓及其葉片上分離到一株對草莓灰霉病有明顯抑制作用的酵母菌N1，結合生理生化特性和26S rDNA D1/D2區序列比對，鑒定為季也蒙畢赤酵母(Pichia guilliermondii)，研究了N1對采后草莓冷藏品質的影響，探索了該菌種在草莓采后貯藏保鮮中應用的可能性，以尋求一種理想、安全的方法控制草莓采后病害。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

“豐香”(Toyonoga)草莓 江蘇省南京馬群草莓種植基地;灰葡萄孢 分離自草莓果實。

YX280B型手提式不銹鋼蒸汽消毒器 上海三申醫療器械有限公司;SW－CJ－ID型單人凈化工作臺

蘇州凈化設備有限公司;NIKON顯微鏡 日本尼康;BSA124－CW電子天平 賽多利斯有限公司;移液槍(100μL、1000μL) 北京金花;SPX－150B－Z型生化培養箱 上海博訊實業有限公司醫療設備廠; HZQ－F160型全溫振蕩培養箱 太倉市實驗設備廠。

1.2 拮抗酵母菌的分離與篩選

1.2.1 拮抗酵母菌的分離純化 將10g果實樣品研磨成漿，葉片1～2片，分別加入100mL無菌水，在250r/min下充分振蕩 30min，做梯度稀釋(10－5～10－7)，各取100μL涂布于PAD平板上，28℃下培養2～3d，挑取特征各異的酵母菌單菌落，反復平板劃線分離、純化。

1.2.2 拮抗菌的篩選

1.2.2.1 離體篩選 平板對峙法:先將供試拮抗酵母菌株和病原菌分別進行平板活化，然后采取網格的方式用接種環將拮抗酵母菌株接入PDA平板，同時在PDA平板中央打孔接入培養了7d左右的灰霉菌，28℃下培養5～7d，測量灰霉的直徑大小。每個處理3個平板，實驗重復3次。

將上述有效的拮抗酵母菌株采用以上方法進行復篩。每個處理3個平板，實驗重復3次。

1.2.2.2 活體篩選 在草莓果實腰部用用已滅菌的打孔器打1個直徑為3mm(寬)×4mm(深)的孔，每孔注入20μL的5×108CFU/mL拮抗酵母菌懸液，以無菌生理鹽水作為對照(CK)，2h后都接種20μL的5×105spore/mL病原菌孢子懸液，室溫晾干后，果實放于一次性可降解塑料盒內，貯藏于25℃、RH 95%的恒溫培養箱中。每組處理30個果實，3d后測定果實病斑直徑，計算防治效果。

1.3 拮抗酵母菌鑒定

1.3.1 菌落性狀與生理生化特征 將拮抗酵母菌接種于PDA平板上，28℃培養2d后觀察它的生長特征和形態特征。參照文獻［10］鑒定菌株的生理生化特征。

1.3.2 26S rDNA序列分析鑒定［11－12］酵母菌 26S rDNA通用引物由生工生物工程(上海)有限公司合成，進行序列測定并構建系統發育樹。

1.4 不同濃度酵母菌液對草莓病斑直徑的影響

拮抗酵母菌液濃度分別為 5×106、5×107、5×108、5×109CFU/mL。處理方法同1.2.2.2。實驗重復3次。

1.5 拮抗酵母菌N1處理對草莓冷藏效果的影響將果實隨機分成兩組，一組浸漬5×108CFU/mL N1酵母菌懸液30s作為處理組，另一組浸漬生理鹽水作為對照組，分別浸漬30s。室溫晾干后，將果實放于一次性可降解塑料盒內，貯藏于(2±1)℃、RH 90%～95%下。每隔2d觀察并測定品質指標。每處理500個果實，設3個平行，實驗重復3次。

1.6 指標測定方法

1.6.1 病斑直徑及防治效果 病斑直徑采用十字交叉法測量［13］，防治效果(%)=(對照病斑直徑－處理病斑直徑)/對照病斑直徑 ×100。每處理 30個果實。

1.6.2 貯藏壽命 草莓腐爛指數達15%或失重率達5%時定義為貯藏壽命結束。按下式計算草莓的貯藏壽命:貯藏壽命=Σ(草莓果實對應的貯藏天數×果實個數)/果實總個數。每處理40個果實。

1.6.3 失重率 采用稱重法，失重率(%)=(果實原始質量－測量時質量)/原始質量×100。每處理40個果實。

1.6.4 硬度 采用GY－B型果實硬度計測定。每處理30個果實，取平均值。

1.6.5 可溶性固形物 采用手持折光儀測定。每處理30個果實，取平均值。

1.6.6 色澤 采用MINOLTA CR－200色彩色差儀測定果實表皮顏色的L*、a*和b*值，隨機選取果實腰部平整處進行測定。每處理40個果實，取平均值。

1.6.7 酸含量 采用酸堿滴定法［14］測定。每處理30個果實，取平均值。

1.6.8 VC含量 采用碘滴定法［15］測定。每處理30個果實，取平均值。

1.7 數據處理與分析

實驗數據處理采用 SAS軟件進行處理，采用ANOVA方差分析和鄧肯氏多重比較處理之間的差異顯著性(p=0.05)。

2 結果與分析

2.1 篩選

2.1.1 離體篩選 將分離得到的85株菌通過網格平板對峙實驗進行離體篩選，得到對灰霉病有顯著抑制作用的酵母菌17株，其中顯示出顯著的抑制作用(p＜0.05)拮抗酵母菌為N1、PJ15、PJS5、PJS6、PJS9、 G5(見表1)。

2.1.2 活體篩選 將通過離體篩選得到的6株菌進行活體篩選。通過統計草莓的腐爛率和病斑直徑，評價各株拮抗酵母菌對草莓灰霉病的抑制效果，結果見表2。從草莓上分離的N1、PJS6、PJS9在病斑直徑及發病率上都顯示出極顯著的抑制作用(p＜0.05)，但PJS6、PJS9會在草莓打孔的傷口表面形成一層白色物質，影響外觀。而N1處理下的草莓病斑直徑為0.75cm，比CK組要小0.61cm，防治效果達到45%，對草莓灰霉病顯示出較高的抑制效果。

表1 分離的拮抗菌對灰葡萄孢的抑制Table 1 Inhibition of Botrytis cinereaby the isolated microorganisms

表2 分離的拮抗菌對草莓灰葡萄孢的抑制Table 2 Inhibition of Botrytis cinerea of strawberries by the isolated microorganisms

2.2 拮抗酵母菌N1的鑒定

2.2.1 菌落性狀與生理生化特征 酵母菌N1在PDA平板上形成的菌落(圖1A)成圓形，乳白色，表面隆起，邊緣整齊，直徑2～4mm，表面無光澤，質地粘稠，有芳香味。菌體細胞(圖1B)呈長橢圓形，出芽生殖，(3～10)μm×(1～4)μm(長×寬)。具體生理生化指標見表3。

綜合分析酵母菌N1的形態特征和生理生化特征，參照J.A.巴尼特等［10］的鑒定方法，初步鑒定該酵母菌是季也蒙畢赤酵母(Pichia guilliermondii)。

2.2.2 26S rDNA序列分析鑒定 將N1的測序結果在NCBI數據庫中上進行同源性分析，并構建系統發育進化樹(圖2)。通過比對發現N1與季也蒙畢赤酵母HJM(Pichia guilliermondii strain HJM)、季也蒙畢 赤 酵 母 EXOC14B (P.guilliermondiistrain EXOC14B)的同源性為99%，結合2.2.1結果，初步確定 N1 菌株為季也蒙畢赤酵母(Pichia guilliermondii)，在GenBank中登陸號為JX125041，電泳擴增結果如圖3所示。

圖1 拮抗酵母菌N1的形態特征Fig.1 The morphological characteristic of the antagonistic yeast N1

表3 酵母菌N1的生理生化特征Table 3 Physiological and biochemical characteristics of N1 yeast strain

圖2 基于26S rDNA D1/D2區序列構建的N1系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on 26S rDNA D1/D2 domain sequences of N1

圖3 N1的PCR擴增結果Fig.3 PCR amplification results of N1

2.3 不同濃度N1酵母菌液對草莓病斑直徑的影響

如圖4所示，使用N1酵母菌懸液處理草莓果實能有效抑制灰霉病病斑的擴展，減輕草莓果實的腐爛，且濃度越高抑制效果越好。其中，經5×108CFU/mL N1酵母菌懸液處理的草莓果實病斑直徑為0.90cm，比對照組1.33cm小了32.3%，對灰葡萄孢有顯著的抑制作用。而 5×108CFU/mL處理結果與5×109CFU/mL的相差不大，故選用5×108CFU/mL濃度作為最佳濃度，并用于后續實驗中。

圖4 不同濃度的N1酵母菌懸液對草莓果實灰葡萄孢發病病斑直徑的影響Fig.4 Effects of different concentrations of N1 on strawberry fruit lesion development of Botrytis cineria infection

2.4 拮抗酵母菌N1處理對草莓冷藏效果的影響

2.4.1 冷藏期間草莓果實失重率、腐爛率變化 隨著貯藏期的延長，處理組與對照組的失重率均有所增加，處理組草莓果實失重率顯著低于對照組(p＜0.05)。對照組在冷藏9d后失重率開始大幅上升，在12d時已達到10.45%。而處理組冷藏前期果實保持較好，冷藏后期失重率才開始明顯升高，冷藏至15d時，處理組果實和對照組果實的失重率分別為4.97%和16.38%(圖5－A)。

對照組部分果實冷藏3d開始出現腐爛現象，表現為外表皺縮，顏色變暗，出現水斑，香氣減少，部分果實霉變;而酵母菌懸液處理組只有個別果實表面有水斑現象，果實風味等感官良好，且無霉變出現，有較好的食用和商品價值，直到9d才有明顯的腐爛現象。冷藏9d時，處理組和對照組腐爛指數分別為9.425%和14.65%。冷藏15d時，處理組果實和對照組的腐爛指數分別為15.55%和30.25%(圖5－B)，有顯著差異(p＜0.05)，此時的對照組大部分已經腐爛。當草莓腐爛率達15%或失重率達5%時定義為貯藏壽命結束，由此可知處理組和對照組草莓的貯藏壽命分別是14d和10d，拮抗酵母菌N1處理延長了草莓的貯藏壽命。

圖5 冷藏期間草莓果實失重率(A)、腐爛率(B)的變化Fig.5 Changes in weight loss rate(A)，decay rate(B)during cold storage

2.4.2 冷藏期間草莓果實硬度和可溶性固形物變化 從圖6－A中可以看出，貯藏期間果實硬度開始會有輕微上升，在貯藏9d后處理組和對照組開始出現差異，處理組草莓硬度較高且略有上升，直至12d時硬度開始下降;而對照組在貯藏9d后硬度開始下降，與處理組區別顯著(p＜0.05)。冷藏12d時，處理組果實和對照組果實的硬度分別為2.29和1.58(圖6－A)，這說明拮抗酵母菌N1較好地保持草莓的感官品質。整個貯藏過程中，處理組和對照組可溶性固形物含量總體均呈下降趨勢，但對照組下降迅速而處理組變化很小，在冷藏6～9d處理組可溶性固形物略微上升波動。冷藏9d后兩組可溶性固形物含量開始出現差異(圖6－B)，對照組迅速下降而處理組開始上下波動。這說明酵母菌懸液處理能夠在一定程度上保持草莓冷藏期間的可溶性固形物含量。

圖6 冷藏期間草莓果實硬度(A)、可溶性固形物(B)的變化Fig.6 Changes in Firmness(A)，Soluble solids content(B)during cold storage

圖7 冷藏期間草莓果實顏色L*、a*和b*值的變化Fig.7 Changes of fruit color (L*，a*and b*values)during cold storage

2.4.3 冷藏期間草莓果實色澤變化 由于草莓果實采摘時只有七八成熟，冷藏過程中，隨著草莓果皮中葉綠素被分解和花青素積累，果實明度和顏色會有所變化?？偟膩碚f，從圖7可以看出，對照組和處理組L*值均顯出下降趨勢，但處理組的效果較好，L*值下降緩慢。前6d處理組和對照組L*值基本保持不變，第9d開始產生分歧，對照組L*值開始隨貯藏時間呈顯著下降趨勢，草莓顏色變暗，嚴重影響商品價值，處理組與空白組趨勢一致，但變化較小(p＞0.05)。由此可見酵母菌懸液處理能在一定程度上保持草莓的光澤。處理組和對照組的a*和b*值差異不顯著(p＞0.05)，均隨貯藏時間延長逐漸增大，這說明果皮顏色逐漸轉紅轉黃，酵母菌懸液處理對草莓果皮的顏色變化沒有太大影響。

2.4.4 冷藏期間草莓果實酸含量和VC含量的變化由圖8－A可知，在貯藏期間，酸含量總體呈下降趨勢。處理組與對照組相比相差不大，這說明拮抗酵母菌并未顯著提高草莓的風味。由圖8－B可知，在貯藏期間，VC含量呈下降趨勢。處理組的最大損失率為36.0%，小于對照組的43.3%，VC損失率較小。這說明拮抗酵母菌一定程度上保存了草莓的營養價值，但是并未產生顯著效果。

圖8 冷藏期間草莓果實可滴定酸含量(A)、VC含量(B)的變化Fig.8 Changes of content of titratable acid(A) and VC(B)during cold storage

3 結果與討論

3.1 本實驗主要是通過離體和活體結合進行拮抗酵母菌的篩選，在離體實驗中N1防效要低于PJS9、PJ15、G5，但在活體實驗時N1卻表現出較好的拮抗效果，這可能由于在離體實驗中，酵母菌占領營養和空間的速度低于病原菌菌絲的蔓延速度;但在果實傷口做拮抗實驗時，酵母菌只要占領傷口的營養和空間就能有效控制病菌的生長。對于果蔬病害生防菌的篩選，一般都根據離體實驗進行篩選［16］，但許多研究表明，平板篩選與其實際的拮抗效果可能沒有必然的聯系［17－18］，本實驗就先通過離體實驗篩選出拮抗效果較佳的6株菌，然后在草莓進行驗證，最終得到了防效較好的拮抗酵母菌N1。

3.2 利用傳統的生理生化特性分析結合26S rDNA D1/D2序列分析對拮抗酵母菌N1的分類地位進行了研究，確定N1為季也蒙畢赤酵母。季也蒙畢赤酵母在蘋果、柑橘、梨、草莓［19－20］等水果用于抑制灰霉、青霉、綠霉、根霉等病害的防治已被廣泛的報道，以往文獻有幾例草莓灰霉病生防菌篩的報道，但篩選到一株對草莓灰霉病具有明顯防效的季也蒙畢赤酵母較少報道。

3.3 拮抗酵母菌N1菌懸液處理對草莓的冷藏品質有積極的作用，雖對草莓風味沒有產生顯著變化，但處理過的草莓貯藏壽命顯著延長，失重率和腐爛率顯著減小，果實硬度和可溶性固形物含量得到較好的維持，草莓果實也保持了較好的光澤。這可能是由于季也蒙畢赤酵母能夠很好地定殖在草莓上面，分泌β－1，3－葡聚糖酶和幾丁質酶等在內的胞外溶解酶來與病原菌爭奪養分和空間［21］，控制果蔬的發病率，減少了腐爛率。Wisniewski等［22］證明了季也蒙畢赤酵母能夠吸附在灰霉的菌絲細胞壁上，改變灰霉某些糖類和蛋白質的完整性。Zhao Yan和Dianpeng Zhang的研究也表明了季也蒙畢赤酵母能誘導寄主包括過氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸氨(PAL)酶和β－1，3－葡聚糖酶等酶［23－24］的活性，這些酶［25］能夠專一性的清除果蔬體內的活性氧或者阻止它們的產生，同時參與果蔬體內酚類物質、植保素、木質素等多種抗性物質的合成，從而延緩了果蔬硬度的下降，提高了抗病性，保證了果蔬的色澤及營養成分，最終起到保護果蔬的作用。

3.4 通過以上實驗可以推測出該拮抗酵母菌具有很大的開發及應用前景。但本研究只是對拮抗酵母菌的篩選鑒定以及對冷藏品質的影響做了簡單的研究，要真正應用于實踐，達到化學防治的效果，還需要將其與其他外源物質結合處理，如殼聚糖、金屬鹽類、植物激素、氨基酸等［26－28］，以達到提高酵母菌防治效果的目的，這些還有待更加深入的研究，而關于田間防效及商業化產品開發也需要進一步的探索。

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Screening and identification of antagonistic yeast against the gray mould disease and effect on quality of postharvest strawberry

QIN Xiao－jie，XU Jiao－jiao，SUO Na，ZHOU Hai－lian，HE Yang，XIAO Hong－mei*
(College of Food Science and Technology，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China)

The antagonistic yeast N1 with a high ability of inhibiting the gray mould(Botrytis cinerea)disease on strawberry was isolated from the strawberry fruits and leaves in Nanjing Maqun with in vitro and in vivo methods.This strain was preliminarily identified asPichia guilliermondiibased on the similarity analysis of its physiologicalbiochemical characteristics and 26S rDNA D1/D2 domain sequence.Pretreatment with different concentrations of N1 could decrease the incidence of rot on postharvest strawberry after inoculation with pathogenic fungiBotrytis cinerea.The result showed that the higher concentration of N1，the inhibition effect on the gray mould disease was better.The best inhibition concentration of N1 was 5×108CFU/mL which could decrease the incidence of rot to 32.3%，compared with rot only inoculating with pathogenic fungi.Postharvest strawberries treated with the antagonist were stored at(2±1)℃ with RH 90%～95%，the results showed that the antagonist treatment had little effect on acid content，but could maintain fruit luster，firmness，soluble solid and vitamin C content，also reduce weight loss rate remarkably and extend storage life.These results revealed a potential commercial application of N1 as an antagonist for controlling the fruit postharvest diseases.

strawberry;biological control;Pichia guilliermondii;Botrytis cinerea

TS205.9

A

1002－0306(2012)21－0330－07

2012－03－29 *通訊聯系人

秦曉杰(1990－)，女，碩士研究生，研究方向:食品科學。

江蘇省科技計劃項目(BE2010385);國家大學生創新性實驗計劃項目(GJ0724);南京農業大學大學生創業項目(1008cy12)。