醇 水交換法提取樺褐孔菌生物活性物質的工藝研究

馬微微，陳文華，王新紅，萬雪蓮，王德才

(哈爾濱醫科大學公共衛生學院，黑龍江哈爾濱 150086)

醇 水交換法提取樺褐孔菌生物活性物質的工藝研究

馬微微，陳文華，王新紅，萬雪蓮，王德才*

(哈爾濱醫科大學公共衛生學院，黑龍江哈爾濱 150086)

目的:利用超聲熱學及空化技術，研究醇－水交換提取樺褐孔菌中的三萜類和多糖生物活性物質的最佳提取工藝。方法:樺褐孔菌粉碎，過30目篩，超聲輔助醇－水交換提取其生物活性物質。結果:醇提三萜類物質最佳工藝為:溫度30℃，時間50min，提取3次，液料比25∶1，得率為1.30%;水提多糖最佳工藝為:溫度50℃，時間40min，提取3次，液料比35∶1，得率為6.96%。結論:超聲輔助醇－水交換提取樺褐孔菌中的生物活性物質的最佳提取工藝穩定、合理可行，能有效提高樺褐孔菌的綜合利用。

樺褐孔菌，醇－水交換，超聲

樺褐孔菌是一種生長在寒帶的木腐菌，主要寄生于白樺樹、銀樺、赤楊等的樹干或樹皮下。在我國主要生長在吉林、黑龍江、西藏、青海等高海拔山區的樺屬樹木上［1］。隨著對樺褐孔菌化學成分研究的不斷深入，大量的活性物質被分離出來，目前已報道的除在水提取物中提取出的多糖外還含有醇提取物三萜類、樺褐孔菌醇和栓菌酸等200多種化學成分。作為樺褐孔菌的主要活性成分，三萜類物質和多糖可用于抗腫瘤、抗艾滋病毒、治療糖尿病［2］、抗衰老［3］、降血壓、調節血脂［4］等。目前對樺褐孔菌三萜類物質和多糖的綜合提取工藝尚很少報道，本文利用超聲熱學空化技術，研究醇、水交換提取樺褐孔菌中的兩種生物活性物質三萜類及多糖物質的最佳提取工藝，充分利用樺褐孔菌資源，為促進樺褐孔菌的開發和綜合利用提供客觀的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樺褐孔菌粉 產自伊春市五營區，40℃條件下烘干、粉碎、過30目篩;無水乙醇 天津市凱通化學試劑有限公司，分析純。

KQ－100DB超聲波譜儀 昆山市超聲儀器有限公司;FW80粉碎機 天津泰斯特儀器有限公司; RE－52A旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠;TD4A離心機 長沙英泰儀器有限公司;HPD－25A真空負壓過濾器 上海昨非實驗室設備有限公司; DZF－6030B真空干燥箱、HWS24電熱恒溫水浴鍋

上海一恒科技有限公司;30目土樣分析篩 南京土壤儀器廠;UV－VIS8500紫外－可見分光光度計 上海天美科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取工藝流程

1.2.2 操作要點 樺褐孔菌清選去雜，40℃條件下烘干、粉碎、過30目篩，取10.0g樺褐孔菌粉樣品，置于乙醇真空回流提取濃縮罐中，以液料比25∶1，30℃提取三次(50min/次)，收集醇提液，過濾，真空減壓濃縮，乙醇回收，濃縮液真空干燥，得三萜類物質;殘渣按液料比35∶1的比例加入蒸餾水，50℃提取三次(40min/次)，合并提取液，過濾，真空減壓濃縮，濃縮液醇沉12h，離心收集沉淀真空干燥，得多糖。

1.2.3 樺褐孔菌三萜類物質、多糖含量的測定 三萜類物質:香草醛比色法［5－6］;多糖:苯酚—硫酸法［7］。

1.2.5 單因素實驗 本研究采用醇－水交換法提取樺褐孔菌中的生物活性物質。按1.2.1的提取工藝，以得率為指標，主要考察提取方法、溫度、時間、提取次數和液料比對三萜類物質和多糖得率的影響。

1.2.5.1 提取方法對得率的影響 三萜類物質的提取:溫度為40℃，液料比20∶1，溶劑為無水乙醇，超聲波功率為100W，采用溶液浸提法與超聲輔助提取法，分別提取20、40、60min，提取三次。

多糖的提取:溫度為50℃，液料比20∶1，溶劑為蒸餾水，超聲波功率為100W，采用溶液浸提法與超聲輔助提取法，分別提取30、40、50min，提取三次。

1.2.5.2 提取溫度對得率的影響 三萜類物質的提取:固定提取時間為40min，液料比20∶1，超聲波功率為100W，分別在溫度為20、30、40、50℃中提取，測得率。

多糖的提取:固定提取時間為40min，液料比20∶1，超聲波功率為100W，分別在溫度為40、50、60、70、80℃中提取，測得率。

1.2.5.3 提取時間對得率的影響 三萜類物質的提取:固定提取溫度為40℃，液料比20∶1，超聲波功率為100W，分別在時間為20、30、50、60min時提取，測得率。

多糖的提取:固定提取溫度為 50℃，液料比20∶1，超聲波功率為100W，分別在時間為30、40、50、60min時提取，測得率。

1.2.5.4 提取次數對得率的影響 三萜類物質的提取:固定提取溫度為40℃，液料比20∶1，超聲波功率為100W，提取時間為40min，分別提取四次，測得率。

多糖的提取:固定提取溫度為 50℃，液料比40∶1，超聲波功率為100W，提取時間為40min，分別提取四次，測得率。

1.2.5.5 液料比對得率的影響 三萜類物質的提取:固定提取溫度為40℃，提取時間為40min，超聲波功率為100W，液料比分別為10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1，測得率。

多糖的提取:固定提取溫度為50℃，提取時間為50min，超聲波功率為100W，液料比分別為20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1，測得率。

1.2.6 正交實驗設計 在對提取溫度、提取時間、提取次數、液料比四種單因素考察的基礎上，選用正交表L9(34)進行正交實驗設計。實驗因素與水平設計見表1、表2。

表1 醇提因素與水平L9(34)Table 1 Factors and levels on alcohol extraction conditions

表2 水提因素與水平L9(34)Table 2 Factors and levels on water extraction conditions

1.2.7 醇析濃度對多糖得率的影響 取等體積的水提液5份，每份100mL，分別加入100、200、300、400、500mL的無水乙醇，靜置12h后，離心收集沉淀，烘干稱重，并記錄。

1.2.8 醇沉溫度對多糖得率的影響 乙醇沉淀法提取多糖時，醇沉的溫度是影響多糖得率的重要因素，本實驗采用不同溫度(4、25℃)來沉淀多糖，測多糖得率。

2 結果與討論

2.1 三萜類物質含量測定

以吸收度(y)對齊墩果酸含量(x)進行回歸，得標準曲線方程為y=0.0027x，r2=0.998。

2.2 多糖含量測定

以吸收度(y)對葡萄糖含量(x)進行回歸，得葡萄糖標準曲線方程為y=9.3596x－0.0143，r2=0.995。

2.3 單因素實驗

2.3.1 提取方法對得率的影響 超聲波提取技術［8］是利用超聲波特殊的強縱向振動，高速沖擊破碎，產生空化效應，以達到攪拌及加熱等物理性能。破壞提取物細胞結構，使溶媒能滲入細胞內部，從而加速有效成分的溶解，提高有效成分的提出率，實驗對比分析證明超聲波提取可大大縮短提取時間，提高提取率，并且不改變有效成分的結構［9］。由圖1可見，在提取三萜類物質和多糖中，在同一時間點采用超聲波輔助法的提取率均高于傳統水浴法，具有省時、高效、節能、易操作等優點;溫度高時會有部分提取物分解，而超聲波提取能在低溫條件下保證提取物的得率。因此，超聲輔助法優于傳統水浴提取。

圖1 提取方法對得率的影響Fig.1 Effect of methods on extraction yield

2.3.2 溫度對得率的影響 由圖2可見，超聲波輔助方法提取溫度低時溶出物少，有效成分含量低;隨著溫度增加，細胞膜破碎程度增強，溶出物增多，同時溫度增加可以加快溶劑的運動速度，減少溶質在固體表面的吸附作用，使細胞中活性物質迅速進入到溶劑中，得率也就增高。但值得注意的是:溫度過高對溶解物破壞的可能性大。三萜類物質在40℃時得率最高，達到1.30%;多糖在50℃時得率最高，達到6.87%。

圖2 溫度對得率的影響Fig.2 Effect of temperature on extraction yield

2.3.3 時間對得率的影響 提取時間決定著生產的周期，是生產工藝研究中的一個十分重要的影響因素，它決定著生產成本和能源的消耗。由圖3可見，在一定時間范圍內，得率隨時間的增加而增加。這是由于超聲時間較短時，溶出物較少，提取物含量較低;隨著時間增加，細胞膜破碎程度增強，溶出物增多，得率隨之增高。三萜類物質、多糖分別在50、40min時得率最高，分別為1.3%、6.87%。當時間過長有效成分已經完全溶出，細胞壁進一步破碎，溶解雜質相應增加，得率反而降低，違背了縮短工時，減少能耗的原則。

2.3.4 提取次數對得率的影響 由圖4可知:得率是隨著提取次數的增加而增加的。在提取三萜類物質和多糖實驗中，提取三次均比提取兩次更為明顯的增加，而提取四次較三次而言略微改變。考慮到費時因素，避免浪費能源，增加濃縮工序的難度，選擇提取三次作為最佳提取次數。

圖3 時間對得率的影響Fig.3 Effect of time on extraction yield

圖4 次數對得率的影響Fig.4 Effect of times on extraction yield

2.3.5 液料比對得率的影響 由圖5可見，當乙醇提取三萜類物質，液料比在10∶1～20∶1時，三萜類物質得率隨著液料比的增加而增加，隨后得率隨之下降，

在液料比為20∶1時得率最高，為1.32%。可知，溶劑量過小，提取物質不能完全溶出;溶劑量過大時，超聲波輻射又被溶劑大量吸收，從而影響得率。當水提取多糖，液料比在20∶1～30∶1時，多糖得率隨著液料比的增加而增加，在液料比30∶1～35∶1時得率之間無顯著差異，隨后得率隨之下降。由于浸提液的后續工序中需濃縮，若水量增加，工序也隨之增加，因此水提多糖液料比選為30∶1。

圖5 液料比對得率的影響Fig.5 Effect of ratio of solvent to material on extraction yield

2.3.6 醇析濃度對多糖得率的影響 乙醇沉淀法提取多糖時，乙醇的濃度對多糖得率影響很大。一般情況下，多糖的分子量越大，被沉淀下來所需的乙醇濃度就越小。由圖6可見，當乙醇用量為水提取液3倍時，得率最高，當乙醇用量大于水提取液3倍時，多糖得率隨之下降，這是由于隨乙醇濃度升高，一些多糖中醇溶蛋白分子溶于乙醇中，有些多糖分子與醇溶蛋白相結合，使多糖也溶于乙醇溶液中，不被沉淀下來，造成多糖得率的降低。

圖6 醇析濃度對多糖得率的影響Fig.6 Effect of ethanol concentration on extraction yield of polysaccharides

2.3.7 醇沉溫度對多糖得率的影響 醇沉法就是利用有效成分能溶于乙醇而雜質不溶于乙醇的特性，在加入乙醇后，有效成分轉溶于乙醇中而雜質則被沉淀出來［10］。醇沉溫度低，沉淀物析出與沉降的速度加快，所需的靜置時間短，反之則長。由實驗結果得知，在4、25℃條件下，多糖得率分別為6.86%和6.25%。由此可見，4℃醇沉效果明顯好于25℃，這是由多糖在不同的溫度下溶解度不同造成的。

2.2 正交實驗

根據表3三萜類物質正交實驗結果直觀分析得知，影響因素顯著性順序為:D＞C＞B＞A，得率最高組合為A1B3C3D3，即以溫度30℃，時間50min，提取3次，液料比25∶1。為了對三萜類物質正交實驗的最優化條件進行驗證，采用此組合，做了3次平行驗證實驗，所測得三萜類物質分別為1.28%，1.30%，1.32%，平均值為1.30%，驗證實驗的數值與優化的結果相吻合，說明正交實驗的結果是可行的。

表3 樺褐孔菌三萜類物質提取條件的L9(34)正交實驗結果Table 3 Results of orthogonal test on triterpenoids extraction conditions

根據表4多糖正交實驗結果直觀分析得知，影響因素顯著性順序為:D＞C＞B＞A，正交實驗最優組合為 A2B2C3D3，即以提取溫度50℃，提取時間40min，提取3次，液料比35∶1。但表4中沒有此項組合，故按此組合重新進行實驗，通過3次平行實驗，測得多糖分別為6.99%、6.95%、6.93%，平均值為6.96%，高于表4出現最高值，故采用此組合為最優組合。

表4 樺褐孔菌多糖提取條件的L9(34)正交實驗結果Table 4 Results of orthogonal test on polysaccharides extraction conditions

3 結論

本研究利用超聲熱學及空化技術，研究醇－水交換提取森林藥食兩用多孔真菌—樺褐孔菌中的生物活性物質的最佳提取工藝及技術。采用單因素實驗和正交實驗對超聲波輔助提取樺褐孔菌中的生物活性物質的最佳工藝條件進行優選。得出三萜類物質最佳提取工藝為:溫度30℃，時間50min，提取3次，液料比25∶1，得率為1.30%;多糖最佳提取工藝為:溫度50℃，時間40min，提取3次，液料比35∶1，得率為6.96%。

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Study on the method for ethanol－water exchanging extraction of biological activity content fromInonotus obliquus

MA Wei－wei，CHEN Wen－hua，WANG Xin－hong，WAN Xue－lian，WANG De－cai*(College of Public Health，Harbin Medical University，Harbin 150086，China)

Objective:To studya method forethanol－waterexchanging extraction oftriterpenoidsand polysaccharides fromInonotus obliquusby ultrasound thermal and cavitation technology.Methods:ShatteredInonotus obliquus，filtered them by 30 mesh filter sieve，extracted biological activity content by ethanol－water exchanging and ultrasonic technology.Results:The ethanol optimum extraction of triterpenoids was as follow: extraction temperature 30℃，time 50min，extraction times 3，the rate of liquid and solid 25∶1，and the best extraction was 1.30%.The water optimum extraction of polysaccharides was as follow:extraction temperature 50℃，time 40min，extraction times 3，the rate of liquid and solid 35∶1，and the best extraction was 6.96%.Conclusion:The optimum extraction which ethanol－water exchanging extraction of biological activity content fromInonotus obliquusby ultrasonic technology was steady，reasonable and improve comprehensive utilization ofInonotus obliquuseffectively.

Inonotus obliquus;ethanol－water exchanging;ultrasound

TS201.2

B

1002－0306(2012)21－0273－04

2012－04－13 *通訊聯系人

馬微微(1985－)，女，碩士研究生，研究方向:植物化學生物活性物質的提取、鑒定、保健功能。