產苯乳酸乳酸菌的篩選鑒定

劉長建，劉 秋，姜 波，孫天竹，閆建芳

(大連民族學院生命科學學院，遼寧大連 116600)

產苯乳酸乳酸菌的篩選鑒定

劉長建，劉 秋，姜 波，孫天竹，閆建芳

(大連民族學院生命科學學院，遼寧大連 116600)

利用厭氧培養法，從豬的盲腸、小腸、大腸和糞便中篩選得到24株乳酸菌，液相色譜法測定產苯乳酸，有7株乳酸菌的苯乳酸產量在80～110mg/L之間，有4株的產量超過119mg/L，其中分離自豬糞便的菌株r16的苯乳酸產量最高，達到233.0mg/L。經16S rDNA系統發育分析，結合菌落形態、細胞形態、生化反應實驗，最終確定菌株r16和m15為植物乳桿菌，而菌株m343和m462為糞腸球菌。

豬，乳酸菌，苯乳酸，鑒定

抗生素的長期使用導致了耐藥病原菌的產生，這些病原菌和抗生素本身會通過肉蛋等食物在人體內富集，因此抗生素的使用正在被逐步取消和嚴格控制。有機酸在幾年內可作為抗生素的替代品，而苯乳酸(phenyllactic acid，PLA)，就是一種新型的有機酸類抑菌物質，與細菌素相比，苯乳酸具有更廣的抑菌譜，對革蘭氏陽性菌如金黃色葡萄球菌、單核增生性李斯特菌，革蘭氏陰性菌如大腸桿菌、沙門氏菌和真核微生物如曲霉、青霉等均有抑制作用［1］。其抑菌機理與溶菌酶類似，作用位點是細胞壁，而Nisin等細菌素作用于細胞膜［2－3］;也有研究推測苯乳酸因與苯丙氨酸脫氫酶的底物相似而產生抑制，從而改變了蛋白質的表達［4－5］。苯乳酸能改善宿主的生長性能，是由于其抗菌活性減少了微生物與宿主的競爭，從而減少了營養的損耗;另外，也能降低亞臨床感染的發生率和免疫介質的分泌，從而改善了蛋白質和能量的消化吸收效率［6］。苯乳酸逐漸作為天然防腐劑被應用于食品工業，也用于醫藥和化妝品工業［1，7］，以及替代抗生素應用在養殖業［6］。苯乳酸可由多種微生物產生，如白地霉［8］、紅球菌［5］、丙酸霉［9］和乳酸菌［10－11］。2000年，Lavermicocca［11］分離到的植物乳桿菌21B能發酵產生苯乳酸，產量為56mg/L。Valerio等［12］發現大多數乳酸菌(涉及12個種29株)都能夠產生苯乳酸;但產量較低，苯乳酸的濃度在16.6～99mg/L之間。李興峰等［13］分離的112株乳酸菌中有70株的苯乳酸產量在16.6～91.4mg/L之間。本研究通過高效液相色譜法快速檢測發酵液中苯乳酸含量的方法，從豬消化系統分離出高產苯乳酸的乳酸菌。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

消化系統內容物 采自當地農家300日齡豬的小腸、盲腸、大腸和肛門等部位;苯乳酸(CAS20312－36－1，純度98%，百靈威)等主要試劑 均為分析純產品;PCR反應所用的相關試劑 均購于大連寶生物公司;培養基 包括MRS培養基(Merck)、M17培養基(Oxoid)、PY培養基和PYG培養基。

LC－20AB液相色譜儀 日本島津;CF15RX高速冷凍離心機 日本日立;DNP－9052恒溫培養箱上海精宏等。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳酸菌的初步分離及純化 無菌操作分別從現宰殺的豬的小腸、盲腸、大腸、肛門取內容物。取1.0g樣品加入9.0mL生理鹽水，按10倍梯度稀釋，取100μL分別涂布于含碳酸鈣的2種固體培養基，37℃靜置厭氧培養24～48h。挑取產生溶鈣圈的單菌落，轉接于對應的培養基中，37℃培養24h。篩選過氧化氫酶陰性、革蘭氏陽性、HPLC法檢測產乳酸的菌株進行下一步研究［14］。

1.2.2 高效液相色譜法的苯乳酸檢測 利用反相柱高效液相色譜法［13，15］檢測分析發酵液中的苯乳酸。色譜柱:C18(4.6mm×250mm，5μm，UG120，Shiseido);流動相:A為0.05%三氟乙酸甲醇溶液，B為0.05%三氟乙酸水溶液;洗脫程序:0～20min為10%～90% A;檢測波長:210nm;室溫;流速:1mL/min;進樣量:20μL。

苯乳酸標準曲線的繪制:稱取0.0100g苯乳酸標準品，溶于0.1%磷酸緩沖液(pH2.5)，定容5mL。然后稀釋苯乳酸溶液濃度分別為:0.04、0.08、0.12、0.16、0.20mg/mL。用0.2μm膜過濾各濃度的標準品溶液后用高效液相色譜法測定，以苯乳酸標準液濃度(mg/mL)對峰面積A作標準曲線。得到了苯乳酸標準曲線(圖1)，測出的峰面積(y)與苯乳酸的濃度(x)成正比關系，用此種方法測定菌液苯乳酸產量的變化是切實可行的。

圖1 苯乳酸的標準曲線Fig.1 Standard curve of phenyllactic acid

1.2.3 HPLC法篩選產苯乳酸的乳酸菌 將菌株以5%的接種量分別接種于含2.0g/L苯丙氨酸的MRS和M17液體培養基，37℃靜置培養36h。發酵液離心后取上清，0.2μm的膜過濾。由高效液相色譜測定苯乳酸的含量，篩選出高產苯乳酸的菌株。

1.2.4 乳酸菌的生物學特征 觀察菌落形態，革蘭氏染色后顯微鏡下觀察菌體形態特征;葡萄糖和葡萄糖酸鹽產酸實驗、淀粉水解實驗、石蕊牛奶實驗、明膠液化實驗、乙酰甲基甲醇實驗(V－P實驗)、精氨酸產氨實驗、碳水化合物發酵產酸測定。

1.2.5 乳酸菌的分子生物學鑒定 參照文獻［16］中的微波法稍加修改，提取基因組DNA。以F27(5'－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3')和 R1492(5'－TACGGTTACCTTGTTACGACTT－3')為引物，對其16S rDNA進行擴增。PCR產物委托寶生物公司進行測序。將菌株的測序結果輸入NCBI核酸數據庫中，利用在線Blast程序與NCBI數據庫中的序列進行比對分析，結合 eztaxon網(http://147.47.212.35:8080/ index.jsp)的比對結果。并利用MEGA5.0的基于距離的鄰接法(Neighbor－Joining)，采用Kimura－2參數(Kimura 2－parameter)模型進行系統發育樹的構建。

2 結果與分析

2.1 產苯乳酸乳酸菌的篩選

從豬源消化系統中分離到產生溶鈣圈的疑似菌株146株，其中24株的接觸酶反應為陰性，經革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察皆為陽性菌。

24株乳酸菌在添加了苯丙氨酸的培養基中，37℃靜置培養36h后，將樣品的發酵液濾液進行檢測，結果發現樣品在保留時間13.896～13.987min時有明顯的峰，與標準樣品出峰時間(13.937min)一致，液相色譜圖見圖2。結果表明24株乳酸菌均能轉化苯丙氨酸產生苯乳酸，其中有11個菌株能夠至少產80mg/mL苯乳酸。從中篩選4株高產苯乳酸的乳酸菌m15、r16、m343、m462，其中乳酸菌m15和r16是從豬的糞便中分離的，而乳酸菌m343分離自盲腸，菌株m462來自小腸(表1)。乳酸菌r16苯乳酸的產量遠遠高于其它菌株，達到233.0mg/L;而乳酸菌m15、m343和 m462的苯乳酸產量分別為 131.4、119.4、123.0mg/L。

表1 高產苯乳酸乳酸菌的篩選和其鑒定的結果Table 1 Phenyllactic acid－producing lactic acid bacteria and 16S rDNA identification

2.2 菌落形態、細胞形態和生理生化特性

篩選出的4株乳酸菌革蘭氏染色均為陽性，無芽孢，菌落的邊緣和表面都是整齊的。m15和r16的細胞多數是短桿狀，菌落為乳白色，比另外m343和m462的菌落要稍微扁平一些;而m343和m462多數為球形，其菌落為灰白色。

生化特性實驗結果見表2。4株乳酸菌均不能水解淀粉，石蕊牛奶均產酸，不能使明膠液化，且V－P實驗結果也均為陰性，精氨酸均產氨，均能水解七葉苷。

表2 生化特性實驗結果Table 2 Physiological characteristics of stains

2.3 16S rDNA鑒定

用微波提取乳酸菌基因組DNA，擴增產物在100V電壓下進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳后在紫外燈下可見到清晰的條帶，PCR產物的分子量約為1500bp(圖3)。

圖2 樣品發酵液的HPLC圖譜Fig.2 Chromatograms of strains culture medium supernatant

將測出的菌株 m15、r16、m343、m462的 16S rDNA序列提交到GenBank上，獲得登錄號分別是JQ340028、JN859533、JQ340029、JQ340033(見表1)。與NCBI進行BLAST比對，結果發現菌株m15和r16的16S rDNA序列與多株Lactobacillus plantarum的16S rDNA序列同源性最高。經過MEGA軟件的遺傳距離分析，與L.plantarumJCM 1149的同源性都達到99.8%。用MEGA5.0構建系統發育樹(圖4)，顯示與L.plantarumJCM 1149聚在同一個分支。結合菌株的形態特征、生理生化特征，因此可將乳酸菌m15和r16鑒定為L.plantarum。

而m343、m462菌株的16S rDNA序列與多株Enterococcus faecalis的16S rDNA序列同源性最高，與eztaxon網上比對結果一致。經過MEGA軟件的遺傳距離分析，與E.faecalisJCM 5803的同源性都達到99.9%。從GenBank中調取的親緣關系相近的16S rDNA全序列進行聚類分析(圖4)，菌株 m343和 m462與E.faecalisJCM 5803在同一分支上。結合菌株的形態特征、生理生化特征，可以確定菌株m343和m462都屬于腸球菌屬(Enterococcus)中的糞腸球菌(E.faecalis)。圖4中分枝上的數值為自舉(No.of Bootstrap Replicaion)1000次的結果。

圖3 乳酸菌的16S rDNA純化后的電泳圖譜Fig.3 Electrophoresis pattern of purified 16S rDNA of strains

圖4 菌株m15、r16、m343、m462和參比菌株的16S rDNA基因同源性的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree based 16S rDNA sequences similarity of strain m15，r16，m343，m462 and the reference strains

3 結論

乳酸菌在自然界中分布廣泛，可棲居于人和動物的消化道及其它器官內，這些特點有利于將來更好地開發利用乳酸菌。本實驗從豬的消化系統分離純化出接觸酶反應為陰性、革蘭氏染色為陽性、能產乳酸的24株乳酸菌。采取在培養基中添加苯丙氨酸的方法，37℃靜置培養36h，利用HPLC法測定乳酸菌發酵液中苯乳酸的產量，篩選出4株高產苯乳酸的菌株，苯乳酸產量均大于119mg/L，其中糞便中篩選出的乳酸菌 r16產苯乳酸的量最高，達到233.0mg/L。

通過形態學、生理生化、16S rDNA序列建樹分析，初步鑒定分離自糞便的菌株r16和m15為植物乳桿菌，而菌株m343和m462為糞腸球菌，分別來自盲腸和小腸。已經有多株植物乳桿菌產苯乳酸的報道［1，11－13，17］，但腸球菌屬產苯乳酸的報道不多，Valerio等［12］從 奶 酪 中 分 離 的 屎 腸 球 菌 ATCC882 (Enterococcus faecium)能產生15.0mg/L苯乳酸，而腸球菌屬其它種，包括糞腸球菌還沒有關于產苯乳酸的報道。本研究和其它研究表明［12，17］，苯乳酸可能是乳酸菌的普遍代謝產物，個體差異大，其產量取決于菌株個體。

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Isolation and identification of phenyllactic acid－producing LAB

LIU Chang－jian，LIU Qiu，JIANG Bo，SUN Tian－zhu，YAN Jian－fang
(College of Life Science，Dalian Nationalities University，Dalian 116600，China)

By the anaerobic culture，24 strains of lactic acid bacteria were obtained from pig’s caecum，small intestine，large intestine and feces，which could produce phenyllactic acid by HPLC.Seven strains produced 80～110mg/L phenyllactic acid(PLA)，and four strains could produce even more than 119mg/L PLA.Strain r16 from feces showed the highest PLA－producing ability(233.0mg/L).Based on 16S rDNA sequencing analysis，combining with its morphological，physiological，and biochemistry test，strain r16 and sain m15 were identified asLactobacillus plantarum，and stain m343 and strain m462 asEnterococcus faecalis.

pig;Lactic acid bacteria;phenyllactic acid;identification

TS201.3

A

1002－0306(2012)21－0192－04

2012－04－05

劉長建(1975－)，男，碩士，工程師，研究方向:應用微生物。

國家自然科學基金面上項目(31070005);中央高校基本科研業務費專項資金資助項目(DC120101031，DC120101034)。