岷山紅三葉草異黃酮合酶基因的克隆及序列分析

胡煥煥，劉 瑞，姬國杰，李衛東，豐慧根，*

(1.新鄉醫學院生命科學技術系，河南新鄉 453000;

2.新鄉醫學院三全學院，河南新鄉 453000)

岷山紅三葉草異黃酮合酶基因的克隆及序列分析

胡煥煥1，劉 瑞2，姬國杰1，李衛東1，豐慧根1，*

(1.新鄉醫學院生命科學技術系，河南新鄉 453000;

2.新鄉醫學院三全學院，河南新鄉 453000)

從岷山紅三葉克隆異黃酮合酶基因，并對序列進行比對和進化分析。建立岷山紅三葉愈傷組織培養體系，采用RT－PCR擴增從愈傷組織總RNA中分離了異黃酮合酶基因，并將其克隆到pGEM－T Easy載體，測序，得到全長1575bp的片段。序列分析表明，異黃酮合酶基因含1575個核苷酸，和大豆等其他植物中異黃酮合酶具有很高的同源性。

岷山紅三葉，異黃酮合酶，基因克隆，序列分析

岷山紅三葉產于甘肅省岷縣，也稱紅車軸草，是著名珍稀的高產優質牧草。1944年由美國引進，在岷縣已有60余年的種植歷史，經多年的選育、馴化，成為當地的優勢草種。1987年經全國飼料牧草品種審定委員會審定登記并命名為岷山紅三葉，被譽為中國第一草［1］。岷山紅三葉中異黃酮含量是1.0%～2.6%，是大豆異黃酮含量的8～10倍［2］。其提取物異黃酮類的主要成分是芒柄花素、鷹嘴豆牙素、異黃酮、染料木素、染料木甙、大豆甙元、大豆甙等，其中鷹嘴豆牙素A和芒柄花素含量最高［3］。并且含有大豆所沒有的異黃酮—鷹嘴豆芽素A、B(被譽為“女性生命素”)，而且比大多數異黃酮的雌激素樣活性高。紅三葉異黃酮作為天然植物雌激素是深受國際市場歡迎的健康食品。研究表明，紅三葉異黃酮能調整人體內分泌，使皮膚細膩富有彈性;有效預防骨質疏松，改善睡眠，對女性更年期綜合癥及其他因雌激素下降引發的各種疾病，具有獨特的功效，又被稱為“女子魅力因子”［4］;能降低血脂、預防冠心病、止痛消腫、抗感染、保護神經系統、延緩衰老等;同時異黃酮還是一種潛在的抗癌物質，對結腸癌、乳腺癌等有防治作用。異黃酮的合成源自類黃酮生物合成途徑中生成的中間代謝產物黃烷酮。催化黃烷酮進入異黃酮合成途徑的第一步反應酶為異黃酮合酶，是異黃酮合成途徑的關鍵酶［5－6］。為利用異黃酮的生物學功能，本實驗采用RT－PCR方法克隆岷山紅三葉全長cDNA，對序列進行比對分析，為進一步研究植物異黃酮的生物合成以及進行異黃酮生物工程研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

岷山紅三葉(Trifolium Pratense Minshan);宿主菌Escherichia coliDH5α 為本實驗室保存;T載體pUGM－T Easy Promege公司;限制性內切酶EcoRⅠ、Taq酶 NEB公司;DL2，000TMDNA Marker、DL10，000TMDNA Marker、PrimeScript RT－PCR Kit、Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0、MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.2.0、RNAiso－mate for Plant Tissue、RNAiso Plus(Total RNA提取試劑) 大連寶生物。

梯度PCR擴增儀C1000 Bio－Rad Laboratory;電泳儀DYY－2 北京市六一儀器廠;Touching 956數碼相機凝膠成像系統 上海天呈科技有限公司;高速冷凍離心機Neofuge 23R 上海力申科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 愈傷組織培養體系的建立

1.2.1.1 無菌外植體的制備 選擇無病斑，籽粒飽滿，顏色均一的紅三葉種籽，脫毒，種籽在自來水下沖洗20min，用75%的乙醇浸泡1min，5%有效氯濃度次氯酸振蕩清洗20min，無菌水沖洗三次，每次不少于兩分鐘，濾紙吸干水分，播種在不添加激素的MS+10g蔗糖+6%瓊脂的培養基上，16h光照，8h黑暗，25℃，培養一周。

1.2.1.2 愈傷組織的誘導 分離幼苗子葉和下胚軸，將下胚軸切成5mm長的小段，子葉切成兩瓣，分別接種于MS+20g/L蔗糖+0.6%瓊脂的基本培養基，添加2mg/L 2，4－D，0.5mg/L 6－BA［7］。(25±2)℃，暗培養。每隔一周觀察一次，記錄生長情況。

1.2.1.3 愈傷組織的繼代培養 誘導出的愈傷組織繼代培養條件為，MS+0.5mg/L 6－BA+0.5mg/L 2，4－D，每隔一周觀察并記錄一次。

1.2.2 引物的合成和總RNA的提取 依據GeneBank的異黃酮合酶序列(AY253284.1)［8］設計引物，由Invitrogen公司合成。

同 源 引 物:IFSHONG1 5'ATGTTGTTAG AAATTGCAGTTGC3';

互補引物:IFSHONG25'TTAAGAGGAAA GGAGTTTAGCTG3';

取生長狀態良好的愈傷組織提取總RNA:取繼代一次，生長穩定的岷山紅三葉愈傷組織一塊(約300mg)，在液氮中研磨至粉末狀，加入1mL植物組織RNA提取輔助劑，繼續研磨至裂解液透明，迅速轉入1.5mL Eppendorf管，12000r/min 4℃ 離心5min;小心吸取上清液平均分至2個新的1.5mL Eppendorf管，各約500μL;各加入500μL的RNAiso Plus振蕩混勻，靜置5min;隨后加入200μL氯仿，劇烈振蕩15s，靜置5min;12000r/min 4℃離心15min;吸取上清轉移至另一新的離心管中;加入等體積的異戊醇，上下顛倒混勻后，室溫靜置10min;12000r/min 4℃離心10min;小心棄去上清，沿管壁緩慢加入1mL 75%乙醇，輕輕上下顛倒離心管，12000r/min 4℃離心5min后棄去上清;室溫干燥5min;加入40μL的Rnasefree水溶解。－80℃保存，備用。

1.2.3 反轉錄與PCR反應 采用兩步RT－PCR法，反轉錄:總RNA 1μL，Random 6 mers 1μL，dNTP 1μL和Rnase Free dH2O 7μL，反應:65℃ 5min，4℃保存;向上述反應液添加5×Prime Script Buffer 4μL，Rnase Inhibitor 0.5μL，PrimeScript Rtase 0.5μL，Rnase Free dH2O 5μL，反應:30℃ 10min，42℃ 20min，75℃ 15min，4℃保存;以岷山紅三葉cDNA為模板，擴增IFS基因，PCR反應體系包含:10×PCR BufferⅡ2.5μL，dNTP Mixtuer 1μL，IFSHONG1、2各 0.5μL，TaKaRa Ex Taq HS 0.25μL，反轉錄反應液2.5μL和Rnase Free dH2O 17.75μL補足25μL;反應程序如下: 94℃變性30s;58℃退火30s;72℃延伸90s(10個循環，每個循環退火溫度下降1℃);94℃變性30s;48℃退火 30s;72℃延伸 90s(25個循環);72℃終延伸5min。

1.2.4 PCR產物的回收、克隆與序列分析 PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析并純化回收，按照TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0說明書操作。按PCR產物克隆試劑盒說明將回收片段與pUGM－T Easy載體連接，轉化E.coliDH5α，在添加Amp、IPTG、X－gal的LB平板上挑取白色菌落。提取質粒DNA后，經限制酶酶切和PCR擴增，選擇有正確插入片段的克隆，測序。

2 結果與分析

2.1 IFS基因的克隆

PCR產物電泳結果分析表明，擴增得到約1.6kb的片段，與實驗設計要擴增的片段大小相符(圖1)。

圖1 PCR產物Fig.1 Product of PCR

2.2 重組質粒的篩選和鑒定

PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析并純化回收，與pUGM－T Easy載體連接，轉化E.coli DH5α后，挑選白色菌落。提取質粒DNA，經限制酶酶切和PCR擴增驗證，得到約1.6kb片段，與實驗設計要擴增得到的片段大小相符(圖2)。

圖2 重組質粒的限制酶切及圖譜Fig.2 Restriction and PCR amplification map of recombination plasmid

2.3 IFS基因的序列比對分析

克隆產物經正反兩向測序后，拼接結果表明，IFS基因全長1575個堿基，通過Blast與Genbank分析，與已報道的紅三葉異黃酮合酶基因(AY253284.1)的核苷酸同源性為99%(圖3)。同時分析結果表明和其他植物(大豆、蒺藜苜蓿、三野葛、鷹嘴豆等)中異黃酮合酶相比有很高的同源性。氨基酸水平同源性為75%～80%，相似性高達92%～97%。與白三葉，紫花苜蓿和綠豆等中異黃酮合酶更有高達95%～99%的同源性(圖4)。系統發生分析表明紅三葉異黃酮合酶最接近蒺藜苜蓿(圖5)。

圖3 岷山紅三葉IFS序列Fig.3 Sequence of IFS from Trifolium Pratense Minshan

圖4 紅三葉異黃酮合酶氨基酸序列和其他植物異黃酮合酶的多重序列比對Fig.4 Multiple sequence alignment of IFS－Tp and plant IFS proteins

圖5 系統發生樹分析Fig.5 Phylogenetic analysis of other plant IFS

3 討論與結論

從第一例轉基因煙草的出現，轉基因技術飛速發展，今天它不僅僅是傳統育種的輔助手段，也是植物生物技術和品質改良的核心。由于紅三葉種質資源有限，并且與野生型的種質具有不相容性［9］，使得利用轉基因技術對紅三葉草進行品種改良至關重要。目前國內外研究三葉草多側重于將外源基因導入三葉草基因組，而對三草葉本身具有重要應用價值的基因研究較少。

杜邦公司在2000年首次將大豆IFS基因轉入模式生物擬南芥，并在葉片和莖中檢測到IFS的表達，染料木素含量是2μg/g［10］。Bong Gyu Kim等［5］將紅三葉IFS基因轉化酵母，重組酵母微粒體可以將柚皮素轉化為染料木素。紅三葉中IFS基因是單拷貝，如果將克隆的IFS片段通過植物表達載體轉回紅三葉基因組，理論上會提高紅三葉中IFS的拷貝數，從而提高異黃酮的產量。

本文通過PCR方法，從岷山紅三葉的愈傷組織中克隆了異黃酮合酶基因(IFS)，該基因全長1575個核苷酸，編碼525個氨基酸，與已報道的紅三葉異黃酮合酶基因核苷酸同源性99%。該基因的克隆為下一步將IFS基因導入紅三葉，改良紅三葉草種質，提高紅三葉的藥用價值創造了條件，為研究植物異黃酮的生物合成以及進行異黃酮生物工程研究奠定基礎。

［1］賈學輝，李保財.岷山紅三葉小草大產業［OL］.http:// www.gsei.com.cn/.2010.

［2］李福林.試論岷縣特色高效草業發展現狀及前景［J］.內蒙古草業，2011，23(1):31－34.

［3］Nancy J Engelmann，Adam Reppert，Gad Yousef，et al.In vitro production ofradiolabeled red clover(TrifoliumPratense) isoflavones［J］.Plant Cell Tissue Organ Cult，2009，98(2): 147－156.

［4］張榮泉.大豆異黃酮在保健食品中的應用［J］.食品研究與開發，2011，32(5):I0001－I0001.

［5］Liu C J，Blount J W，Stecle C L，et al.Bottlenecks engineering of isoflavones glycoconjuggates in Arabidopsis［J］.PNAS，2002，99:14578－14583.

［6］Overkamp S，Hein F，Barz W.Cloning and characterization of eight P450 cDNAs from chickpea cell suspension cultures［J］.Plant Science，2000，155:101－108.

［7］厚彥明，師尚禮，杜文華.岷山紅三葉愈傷組織誘導和植株再生研究［J］.草地學報，2008，16(4):359－363.

［8］Kim B G，Song H S，Lee C，et al.Cloning and Expression of Isoflavone Synthase Gene(IFS－Tp)fromTrifolium pratense［J］.Mol Cells，2003，15(3):301－306.

［9］Khosro Mehdi Khanlou，Mansour Karimi，Asad Maroufi，et al.Improvement of plant regeneration and agroba cterium－media ted genetic transfor mation efficiency in red C lover(Trifolium pratenseL.)［J］.Research Journal of Biotechnology，2011，6(3): 13－21.

［10］Jung W，Yu O，Lau S C，et al.Identification and expression of isofiavonesynthase.the key enzyme for biosynthesis of isoflavone in legumes［J］.Nat Bio tedldlnoi，2000，18:208－212.

Cloning and sequence analysis of isoflavones synthase gene fromTrifolium Pratense Minshan

HU Huan－huan1，LIU Rui2，JI Guo－jie1，LI Wei－dong1，FENG Hui－gen1，*
(1.Life Science and Technology Department，Xinxiang Medical University，Xinxiang 453000，China;
2.Sanquan Medical College Xinxiang Medical University，Xinxiang 453000，China)

For making good use of the specific biological function of isoflavone.A cDNA fragment from full length IFS gene was amplified by polymerase chain reaction from total RNA of callusTrifolium Pratense Minshan，and it was sequenced after cloned into pGEM－T Easy vectors.A cDNA fragment of 1575bp from full length IFS gene was got.The sequencing results indicated that the cloned fragment of IFS contained 1575 nucleotides，and shared a sequence homology of 99%with that from Genbank accession.

Trifolium Pratense Minshan;isoflavone synthase;gene cloning;sequence analysis

Q943.2

A

1002－0306(2012)21－0178－03

2012－04－18 *通訊聯系人

胡煥煥(1987－)，女，碩士研究生，研究方向:生物制藥。

河南省科技廳重點支持項目(102102310189);河南省教育廳立項項目(2009A180014);新鄉醫學院研究生科研創新支持項目(YJSCX201116Y)。