高壓二氧化碳處理中幾種因素對(duì)蘋果濁汁中大腸桿菌殺菌效果的影響

廖紅梅，胡小松，廖小軍，*

(1.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫 214122;

2.國(guó)家果蔬加工工程技術(shù)研究中心，北京 100083;

3.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083)

高壓二氧化碳處理中幾種因素對(duì)蘋果濁汁中大腸桿菌殺菌效果的影響

廖紅梅1，2，胡小松2，3，廖小軍2，3，*

(1.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫 214122;

2.國(guó)家果蔬加工工程技術(shù)研究中心，北京 100083;

3.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083)

主要研究處理介質(zhì)pH、循環(huán)處理和卸壓速率對(duì)高壓二氧化碳處理對(duì)蘋果濁汁中大腸桿菌殺菌效果的影響。結(jié)果表明:在32℃、10MPa和37℃、20MPa下處理30min，通過降低處理介質(zhì)蘋果濁汁的初始pH能提高殺菌效果;在32～42℃、10～30MPa下以15min為一個(gè)周期來循環(huán)處理也能提高殺菌效果，主要是由于循環(huán)處理中因多次升、降壓造成CO2與微生物細(xì)胞接觸時(shí)間延長(zhǎng)，且多次升、降壓提高了CO2滲透入細(xì)胞的能力，卸壓速率對(duì)HPCD殺菌效果影響不顯著。

高壓二氧化碳，蘋果濁汁，介質(zhì)pH，循環(huán)處理，卸壓速率

蘋果濁汁是渾濁果汁的典型代表，已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外蘋果汁加工發(fā)展的重要方向。天然蘋果濁汁中含有許多微生物，易引起腐敗變質(zhì)，需要通過殺菌來達(dá)到保質(zhì)目的。熱殺菌雖然能夠達(dá)到殺菌目的，但容易引起色澤褐變且產(chǎn)生蒸煮味。非熱殺菌在有效殺菌的同時(shí)也能保持食品的營(yíng)養(yǎng)、風(fēng)味和質(zhì)構(gòu)，對(duì)于熱敏性食品和功能食品的加工具有良好應(yīng)用前景。高壓二氧化碳?xì)⒕夹g(shù)(High pressure carbondioxide，HPCD)是一項(xiàng)新型非熱殺菌技術(shù)，并逐漸成為國(guó)際學(xué)者的研究熱點(diǎn)［1］。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，HPCD早期主要對(duì)成分單一的液態(tài)媒介殺菌，包括培養(yǎng)基、緩沖液和生理鹽水。而近年來HPCD逐漸被應(yīng)用在成分復(fù)雜的食品體系，主要有液態(tài)食品，包括果汁(如蘋果汁、橙汁、葡萄汁、椰汁、梨汁、西瓜汁、橘汁和胡蘿卜汁)、牛奶、啤酒和蘋果酒［2－7］。它也應(yīng)用于固態(tài)食品如紫花苜蓿種子、豬肉、韓國(guó)泡菜及菠菜葉［8－11］，較少研究涉及到天然產(chǎn)物如人參粉等［12］。HPCD技術(shù)因既能鈍化果蔬汁中內(nèi)源酶，如果膠甲酯酶［13］、辣根過氧化酶［14］，又能殺滅其中微生物，對(duì)于果蔬汁產(chǎn)品品質(zhì)提高及延長(zhǎng)保質(zhì)期具有巨大潛力。影響HPCD殺菌效果的加工因素主要有壓強(qiáng)、溫度、時(shí)間、處理系統(tǒng)、氣體組分、CO2狀態(tài)、卸壓速率、循環(huán)處理、添加劑和攪拌等［1，15］。其中幾乎在所有的文獻(xiàn)中都研究了壓強(qiáng)、溫度和時(shí)間對(duì)殺菌效果的影響。而對(duì)處理介質(zhì)pH、循環(huán)處理和卸壓速率對(duì)HPCD殺菌效果的影響研究較少，為更好地理解HPCD殺菌，本文主要研究這三個(gè)因素如何影響HPCD對(duì)蘋果濁汁中大腸桿菌(E.coli)的殺菌效果。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮紅富士蘋果 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)附近市場(chǎng)，4℃冷庫(kù)中貯藏;大腸桿菌 中國(guó)普通微生物菌種保藏中心(China General Microbiological Culture Collection Center，CGMCC)，編號(hào)為CGMCC 1.90;營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基和孟加拉培養(yǎng)基 北京奧博星生物科技有限公司;二氧化氯消毒液 北京綠先鋒科技有限公司;二氧化碳，純度為99.5% 北京京城氣體有限公司。

高壓二氧化碳?xì)⒕b置 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)研制，型號(hào)CAU－HPCD－1;ZDX－35BI型座式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠;DHP－9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司;SW－CJ－1FD型無菌操作臺(tái) 蘇州尚田潔凈技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蘋果濁汁制備 蘋果經(jīng)清洗后切成1cm3左右小塊，用榨汁機(jī)進(jìn)行榨汁，用四層紗布過濾除渣，得到蘋果濁汁(pH3.61～3.91，11.5°Bx)。所用蘋果濁汁在121℃下滅菌15min，冷卻后于4℃放置待用。

1.2.2 微生物培養(yǎng) 根據(jù)CGMCC指導(dǎo)書將大腸桿菌的凍干菌粉經(jīng)過液體營(yíng)養(yǎng)肉湯(NB)活化兩次以后活力得到復(fù)壯，并接種在營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上2℃保藏。用接種環(huán)接種3環(huán)到100mL營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37℃下培養(yǎng)。采用比濁法測(cè)定大腸桿菌的生長(zhǎng)曲線，確定其達(dá)到穩(wěn)定生長(zhǎng)初期所需時(shí)間。以后每次實(shí)驗(yàn)均培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間以達(dá)到其生長(zhǎng)穩(wěn)定初期。培養(yǎng)好的菌液接入無菌蘋果濁汁中，其菌濃度為1.03～6.75×107CFU/mL。

1.2.3 HPCD處理 將與反應(yīng)釜相連的無菌操作臺(tái)紫外滅菌30min以上。清洗HPCD設(shè)備的反應(yīng)釜，蓋上反應(yīng)釜蓋子，密封好后將反應(yīng)釜用真空泵抽真空，用50mg/L的二氧化氯消毒液浸泡20min，再用無菌水沖洗3遍以上以除去反應(yīng)釜中殘留的二氧化氯。將反應(yīng)釜預(yù)熱到設(shè)定溫度，然后無菌操作將100mL樣品(微生物菌液)泵入反應(yīng)釜中。經(jīng)過3～7min的升壓過程達(dá)到設(shè)定壓強(qiáng)，菌液在恒定的壓強(qiáng)和溫度下進(jìn)行處理，處理時(shí)間達(dá)到后，經(jīng)過約3～10min的卸壓，從與無菌操作臺(tái)相連的管道將處理后的樣品放出，用無菌瓶收集。迅速冷卻，檢驗(yàn)前于4℃下放置，6h內(nèi)測(cè)殘存菌數(shù)。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在循環(huán)處理實(shí)驗(yàn)中，先升壓到預(yù)設(shè)壓強(qiáng)，保壓15min，立即卸壓作為一個(gè)循環(huán)，之后立即升壓進(jìn)入另一個(gè)循環(huán)處理。根據(jù)總處理時(shí)間為15、30、45、60、75min分別循環(huán)處理1、2、3、4、5次;在卸壓速率實(shí)驗(yàn)中，通過調(diào)節(jié)卸壓閥門控制卸壓速率以檢驗(yàn)HPCD卸壓速率對(duì)殺菌效果的影響。但由于設(shè)備條件所限無法監(jiān)測(cè)得到CO2流量，故通過卸壓時(shí)間分別為3、6、9、12、15min來體現(xiàn)卸壓速率。在研究介質(zhì)pH對(duì)HPCD殺菌效果影響實(shí)驗(yàn)中，采用0.1N NaOH或HCl調(diào)節(jié)蘋果濁汁的pH，使其pH在3～8之間，然后再在不同的壓強(qiáng)和溫度條件下進(jìn)行處理。

1.2.5 微生物數(shù)量測(cè)定 采用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定微生物數(shù)目。將菌液用0.85%生理鹽水以10倍稀釋法進(jìn)行逐級(jí)稀釋，根據(jù)細(xì)菌數(shù)量選擇合適的稀釋度進(jìn)行逐級(jí)稀釋，吸取連續(xù)3個(gè)不同稀釋度的稀釋樣1.0mL于滅菌平皿中，倒入約15mL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，搖勻后在(37±0.1)℃條件下培養(yǎng)24h，并記錄菌數(shù)。

殺菌效果采用殘活率對(duì)數(shù)值(LogN/N0)表示，其中:N0為HPCD處理前的初始微生物數(shù)量(CFU/mL); N為HPCD處理后的微生物數(shù)量(CFU/mL)。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次，數(shù)據(jù)采用方差分析(AOVA)。數(shù)據(jù)采用Origin 7.5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 循環(huán)處理對(duì)HPCD殺菌效果的影響

圖1所示為循環(huán)式脈沖HPCD處理對(duì)其殺菌效果的影響。在32℃、10MPa下循環(huán)處理2～3次后殺菌效果沒有顯著變化，但是循環(huán)處理4次以上則殺菌效果顯著提高。在37℃、20MPa條件下，經(jīng)過循環(huán)處理后HPCD殺菌效果顯著提高，循環(huán)處理2次后殺菌效果提高1.4對(duì)數(shù)。在42℃、30MPa條件下，隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，循環(huán)處理與普通HPCD處理之間的殺菌效果差異越來越小，在75min時(shí)兩者完全重合，達(dá)到完全滅菌。隨著壓強(qiáng)和溫度升高、處理時(shí)間延長(zhǎng)，循環(huán)處理與普通HPCD處理之間的殺菌效果差異呈現(xiàn)先增加后逐漸降低的趨勢(shì)，這與HPCD的殺菌效果不是僅由一個(gè)因素控制有關(guān)。在處理強(qiáng)度較低時(shí)，循環(huán)處理能夠逐漸體現(xiàn)其殺菌優(yōu)勢(shì);但是隨著殺菌強(qiáng)度逐漸提高，其他因素如壓強(qiáng)、溫度等成為殺菌的主導(dǎo)因素。在前人的研究結(jié)果中推測(cè)由于多次升、降壓對(duì)微生物細(xì)胞造成的“爆破”效應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞破裂而亡，進(jìn)而提高殺菌效果。通過掃描電鏡對(duì)37℃、10MPa處理30min的大腸桿菌細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示。即使在30min內(nèi)將循環(huán)次數(shù)提高到3次對(duì)大腸桿菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)、完整性也沒有造成顯著影響。由此可見，循環(huán)處理提高殺菌效果是由于CO2與微生物細(xì)胞接觸時(shí)間延長(zhǎng)(由于多次升、降壓造成)，且多次升、降壓提高了CO2滲透入細(xì)胞的能力造成。

2.2 卸壓速率對(duì)HPCD殺菌效果的影響

如圖3所示，在卸壓時(shí)間分別為 3、6、9、12、15min條件下HPCD殺菌效果有所波動(dòng)，但是差異并不顯著(p＞0.05)，說明卸壓速率對(duì)殺菌效果影響不大。在HPCD早期研究中，一些研究者認(rèn)為快速降壓是一個(gè)增加破壞細(xì)菌細(xì)胞的因素［16－18］。Liu等［19］得出在7.5MPa，30℃處理30或90min使釀酒酵母以及藍(lán)色犁頭霉孢子的生存能力和生物活性顯著受到CO2卸壓速率的影響。但是這一理論卻被其他研究者所質(zhì)疑［20－21］:Arreola等［21］在快速卸壓實(shí)驗(yàn)初期收集了大量完整細(xì)胞;Enomoto等［20］將釀酒酵母在

圖1 循環(huán)式HPCD處理對(duì)蘋果濁汁中大腸桿菌殺菌效果的影響Fig.1 Effect of cycling－pulsed HPCD treatment on inactivation of E.coli in cloudy apple juice

圖2 HPCD與循環(huán)式HPCD處理后大腸桿菌的SEM圖Fig.2 The SEM images of E.coli as exposed to HPCD and cycling－pulsed HPCD treatment

4.0MPa、40℃處理240min后采取快速降壓和慢速降壓兩種不同方式，結(jié)果表明，加快卸壓速率并不一定提高殺菌效果，這表明微生物細(xì)胞的破裂并不主要是由于突然卸壓所致。因此，HPCD殺菌主要在保壓階段，而非快速卸壓階段。

圖3 不同卸壓速率下HPCD對(duì)蘋果濁汁中大腸桿菌的殺菌效果影響Fig.3 Effect of depressure rate on inactivation of Escherichia coli in cloudy apple juice

2.3 處理介質(zhì)pH對(duì)HPCD殺菌效果的影響

圖4所示為32℃、10MPa和37℃、20MPa條件下HPCD不同pH對(duì)蘋果濁汁中大腸桿菌的殺菌效果。隨著pH增加(由酸性到堿性)，HPCD對(duì)大腸桿菌的殺菌效果逐漸降低。在32℃、10MPa條件下處理30min，當(dāng)pH由3.08升高到8.18時(shí)，大腸桿菌活菌數(shù)分別降低了4.69和0.62個(gè)對(duì)數(shù)值。在不同pH條件下，HPCD對(duì)大腸桿菌的殺菌效果在37℃、20MPa較在32℃、10MPa差異更不顯著，說明在較高壓強(qiáng)和溫度條件下pH對(duì)HPCD的殺菌效果影響更不顯著。Damar等［15］認(rèn)為處理介質(zhì)的初始pH對(duì)HPCD的殺菌效果具有重要影響。Lindsay［22］認(rèn)為碳酸像其他帶有羧基的酸一樣在低pH環(huán)境下更容易滲透過細(xì)胞膜，因此能提高殺菌效果。Hong等［23］報(bào)道 HPCD (6.8MPa、30℃)處理醋酸鹽緩沖液(pH4.5)、無菌水(pH6.0)和磷酸緩沖液(pH7.0)中植物乳桿菌達(dá)到降低5個(gè)對(duì)數(shù)值所需要的時(shí)間分別為25、35、60min。但Haas［24］認(rèn)為將處理介質(zhì)用磷酸或鹽酸酸化并不能達(dá)到與CO2一致的殺菌效果，并推測(cè)這種現(xiàn)象可能與這些有機(jī)酸并不能像CO2那樣容易地穿過細(xì)胞膜有關(guān)。另外Wei等［25］在李斯特菌懸浮液中通過添加0.1N HCl使得pH降低1.8個(gè)單位，在6.18MPa條件下處理2h能夠達(dá)到相同的酸化效果，但是前者沒有殺菌效果而HPCD則能達(dá)到完全滅菌。因而可以說明，處理介質(zhì)的pH對(duì)HPCD殺菌效果具有重要影響，但是介質(zhì)pH環(huán)境并不是微生物細(xì)胞死亡的關(guān)鍵因素，CO2在HPCD殺菌過程中起著主導(dǎo)作用。

圖4 HPCD在不同pH條件下對(duì)蘋果濁汁中大腸桿菌的殺菌效果Fig.4 Effect of pH of suspension on inactivation of E.coli in cloudy apple juice exposed to HPCD

3 結(jié)論

HPCD對(duì)蘋果汁中大腸桿菌具有較好的殺菌效果;降低處理介質(zhì)初始pH、循環(huán)處理均能提高殺菌效果;卸壓速率對(duì)HPCD殺菌效果影響不大。因而，在HPCD殺菌過程可以通過降低初始pH，或進(jìn)行循環(huán)處理來提高殺菌效果及縮短處理時(shí)間。

4 展望

從本研究中可以看出，通過42℃、30MPa處理45min后，HPCD對(duì)蘋果汁中大腸桿菌達(dá)到降低5個(gè)對(duì)數(shù)的要求，也即達(dá)到美國(guó)FDA對(duì)果蔬汁中微生物降低5個(gè)對(duì)數(shù)的要求，但是處理時(shí)間較長(zhǎng)，因而在今后的研究中需要進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，或者與天然抑菌劑相結(jié)合，以達(dá)到快速有效殺菌的目的。

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Influence of several factors on the survival ofEscherichia coliin cloudy apple juice as subjected to high pressure carbon dioxide

LIAO Hong－mei1，2，HU Xiao－song2，3，LIAO Xiao－jun2，3，*
(1.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China;
2.National Fruit and Vegetable Processing Technology Center，Beijing 100083，China;
3.College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China)

The influence of initial suspending pH，circle treatment and depressurization rate on the survival of Escherichia coli(E.coli)in cloudy apple juice as subjected to High pressure carbon dioxide(HPCD)were analyzed.The results revealed that the inactivation efficacy increased as decreasing the initial suspending pH asE.coliexposed to HPCD at 32℃and 10MPa，37℃ and 20MPa for 30min.The inactivation efficacy was also increased by circle treatment per each 15min at 32～42℃and 10～30MPa，which might due to enhancement of solubilization of CO2and its contact with bacterial cells during circle treatment by pressurization and rapid depressurization for several times.The decompression rate did not influence the inactivation efficacy significantly in this study.

high pressure carbon dioxide;cloudy apple juice;initialsuspending pH;circle treatment; depressurization rate

TS201.1

A

1002－0306(2012)21－0066－04

2012－05－04 *通訊聯(lián)系人

廖紅梅(1983－)，女，博士，講師，主要從事食品非熱加工技術(shù)方面研究。

國(guó)家自然科學(xué)基金(31101360);教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃(NCET－06－0109);江南大學(xué)基本科研業(yè)務(wù)基金(JUSRP11123)。