GC法測定羥乙基淀粉摩爾取代度的研究

杜中海，任傳杰，于 鵬，宋彥會，袁洪雨

(山東齊都藥業有限公司，山東淄博255400)

羥乙基淀粉(hydroxyethyl starch，HES)為淀粉在酸性條件下水解成一定分子量后，在堿性條件下羥乙基化而成，即位于葡萄糖基上的羥基被羥乙基取代，取代后的淀粉不易被體內的淀粉酶水解，可維持較長時間的滲透壓。一般而言，HES的擴容強度主要決定于體內分子量大小。體內停留時間則主要由HES的羥乙基化程度大小決定。低分子量HES擴容強度小，而高取代級HES因體內停留時間過長可能會發生凝血機制受損和體內蓄積［1］。目前，國內多采用摩根法測定羥乙基淀粉取代度，存在操作繁瑣、檢測誤差大等問題。本文研究了GC法測定羥乙基淀粉摩爾取代度的反應條件、雜質對檢測結果的影響，并與摩根法進行了比較。

1 儀器與試藥

Agilent 7890A氣相色譜儀，羥乙基淀粉標準品(歐洲藥典委員會，Code:Y0001277)，羥乙基淀粉130/0.4(山東齊都藥業有限公司，批號:110601)，碘乙烷、甲苯、氫碘酸等其他試劑均為色譜級。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱:DB－624石英毛細管柱(L=60 m，?=0.53 mm);固定相:6%氰丙基苯基聚甲基硅氧烷(膜厚3 μm);進樣口溫度200℃;程序升溫:50℃維持4 min，以15℃·min－1升至230℃維持4 min;載氣:氮氣;流速:8 mL·min－1;進樣體積:1 μL;分流比:1∶20;FID 檢測器;檢測器溫度280℃;定量方法:內標法;內標物:甲苯;洗脫順序:碘乙烷，甲苯。

2.2 系統適用性試驗 內標溶液的制備:精密吸取甲苯1.0 mL，用二甲苯稀釋至 200.0 mL，即得。

羥乙基淀粉標準品溶液的制備:取羥乙基淀粉標準品約50 mg精密稱定，置反應瓶中，加入0.10～0.15 g己二酸，精密加入1.0 mL內標溶液和2.0 mL氫碘酸，密封。135℃下反應15 h，冷卻至室溫，精密稱定，去掉失重超過5 mg的樣品，分別吸取上清液100 μL，置進樣瓶中，用1.0 mL鄰二甲苯稀釋，密封，搖勻，取1 μL注入氣相色譜儀，測定結果見圖1。

圖1 羥乙基淀粉標準品GC色譜圖

碘乙烷峰在6.28 min，甲苯峰在 9.294 min，無其他雜峰干擾，分離度良好。

2.3 線性關系考察 向7個反應瓶中分別加入己二酸約0.10 ～0.15 g，1.0 mL 內標溶液和 2.0 mL 氫碘酸，密封。用100 μL的定量進樣器分別精密加入約 10 mg、20 mg、30 mg、40 mg、50 mg、60 mg、70 mg 碘乙烷，密封。精密量取反應后的對照溶液各1 μL注入氣相色譜儀，以碘乙烷的質量(mg)為橫坐標，碘乙烷與內標的峰面積比為縱坐標繪制標準曲線，見圖2。

圖2 對照品碘乙烷線性圖譜

線性方程為Y=0.027 5X－0.002 2，線性相關系數r為0.999 9。由線性試驗可知，碘乙烷濃度在 0.30～2.1 mg·mL－1范圍內呈良好的線性關系。

2.4 精密度試驗

2.4.1 GC法測定羥基淀粉取代度 取供試品溶液，精密量取1 μL注入氣相色譜儀，重復6次試驗，記錄色譜圖，計算取代度，結果見表1。

表1 GC法精密度考察表

2.4.2 摩根法測定羥乙基淀粉取代度 摩根法檢測羥乙基淀粉取代度是將羥乙基淀粉經氫碘酸水解，羥乙基轉化成碘乙烷和乙烯，然后分別將二者轉化成碘，進行氧化還原滴定［2］。重復測定6次，結果見表2。

表2 摩根法精密度考察表

比較上述兩種方法可知:GC法檢測羥乙基淀粉取代度準確度高，精密度好，而且一次可同時處理多份樣品，色譜條件耐用性較強，對色譜柱要求不高。摩根法裝置復雜，操作過程繁瑣，且不能同時處理多批次樣品，其測定誤差主要來自于反應的完全程度及氣體泄漏。

2.5 穩定性試驗 依法制備對照品溶液，分別于室溫放置0、2、4、6、8 h，精密量取 1 μL 注入氣相色譜儀，記錄色譜圖，計算取代度，結果見表3。

表3 溶液穩定性考察表

由穩定性試驗結果可知，溶液在室溫放置8 h內，穩定性良好。

2.6 樣品反應條件試驗

2.6.1 依法制備供試品分別于 135 ℃加熱 10、11、12、13、14、15、16、17 h，放冷至室溫，精密稱重，去掉失重超過 5 mg的樣品，精密量取1 μL注入氣相色譜儀，記錄色譜圖，結果見圖3。

圖3 反應時間對取代度的影響

2.6.2 依法制備供試品分別于120℃、125℃、130℃、135℃、140 ℃、145 ℃、150 ℃、155 ℃ 下加熱 15 h［1］，放冷至室溫，精密稱重，去掉失重超過5 mg的樣品，精密量取1 μL注入氣相色譜儀，記錄色譜圖，結果見圖4。

反應溫度低或時間短時，反應不徹底，檢測結果偏低;溫度過高或反應時間過長時，反應瓶的氣密性很難保證。最佳反應溫度為135℃，15 h。

2.7 樣品含水量及含鹽量的影響 將羥乙基淀粉130/0.4樣品暴露吸水后，比較同一取代度不同水分含量測定結果。向羥乙基淀粉130/0.4樣品中加入一定量氯化鈉，比較同一取代度不同氯化鈉含量測定結果［1］，結果見表4。

圖4 反應溫度對取代度的影響

表4 樣品含水量及含鹽量對取代度的影響

結論:樣品中水分含量在2% ～4%，氯化鈉含量在0.5%～15%，在計算過程中扣除水分及氯化鈉，對測定結果無影響。

3 討論

GC法測定羥乙基淀粉摩爾取代度的反應條件研究中，考察了反應溫度與反應時間，結果表明反應溫度與反應時間對測定結果有明顯影響，最佳反應條件為135℃反應15 h。

在不同檢測方法測定取代度的研究中，考察了GC法與摩根法的精密度，結果表明GC法測定的精確度要高于摩根法。在雜質影響的研究中，考察了不同水分含量與氯化鈉含量對測定結果的影響。結果表明水分在2%～4%，氯化鈉在0.5% ～15%對測定結果無影響。通過進行檢測方法的方法學試驗，表明GC法簡便快捷、準確度高，可作為羥乙基淀粉摩爾取代度的檢測方法。

［1］Lee YC，Baaske DM，Carter JE.Determination of the molar substitution ratio of hydroxyethyl starches by gas chromatography［J］.Anal Chem，1983，55(2):334 －338.

［2］Johanson G.Analysis of ethylene glycol ether metabolites in urine by extractive alkylation and electron－capture gas chromatography［J］.Arch Toxicol，1989，63(2):107 －111.