具有3D微納結構PDMS陣列免疫傳感芯片研制*

宗 羽，何巧紅，陳恒武

（浙江大學微分析系統研究所，浙江杭州 310058）

0 引言

抗體微陣列技術是蛋白質微陣列技術的一個重要技術平臺，是以抗體作為捕獲分子，以點陣的形式固定于載體表面，利用抗原—抗體間的特異性反應實現對目標分子的分析檢測。近年來，該技術被廣泛應用于蛋白質組學研究和疾病診斷、藥物篩選、毒理學和藥學、環境和食品分析等研究領域［1，2］。與DNA基因芯片相比，抗體微陣列芯片目前依然面臨諸多挑戰與困難，其中，如何將抗體高效地固定在芯片基底上是研制抗體微陣列芯片的關鍵問題之一。近年來，人們嘗試了多種微陣列基底材料和固定技術，以增加抗體在基底表面的吸附量和穩定性，進而提高檢測信號強度和方法的靈敏度［3］。

聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）是一種生物兼容性良好的有機聚合物，由于具有良好的透光性、透氣性，且價格低廉，加工簡單，近幾年來被廣泛用作制備微流控芯片和DNA陣列芯片的材料［4］。PDMS表面疏水，易吸附蛋白質，因此，它是一種理想的制備抗體微陣列基底材料。為了進一步提高PDMS表面對抗體的吸附能力，文獻［4～6］報道了各種物理或化學表面修飾技術，其中，改變表面形貌，增加比表面是一種有效的措施［7～9］。

本文將化學濕法刻蝕和軟刻蝕技術相結合，以HF刻蝕后的載玻片為陽模，直接澆注制得3D微納結構的PDMS基片，建立了一種簡單、快捷、高效的抗體微陣列芯片加工新技術，并將所制得的3D結構PDMS芯片應用于非均相免疫分析。

1 實驗部分

1．1 微納結構表面的PDMS基片制作

1．1．1 濕法刻蝕制作具有微納結構的玻璃陽模

載玻片（長75 mm×寬25 mm×厚1 mm）用水洗凈，吹干。載玻片的背面貼上保護用的黃膠帶，將其放入濃HF含量≥40%刻蝕液中，20℃下，恒溫振蕩，刻蝕10 min，用水洗凈，吹干，制得表面具有微納結構的玻璃陽模。

1．1．2 澆注法制作具有微納結構表面的PDMS基片

按照文獻［10］的方法澆注PDMS，即將PDMS預聚物和固化劑以質量比為10∶1的比例充分混合、脫氣后倒在玻璃陽模上。待混合物鋪展均勻后，將其置于75℃下加熱1．5 h，固化、脫模，制得具有3D微納結構表面的PDMS基片。為確保PDMS基片的厚度為1 mm，控制每次澆注所需混合物的量為40 mg/cm2。

1．2 抗體微陣列的固定與檢測

將制得的PDMS基片（3D微納結構面朝上）置于另一潔凈的的載玻片上。將5 μL Cy3-羊抗人IgG溶液等間隔地點于PDMS表面，形成抗體微陣列（每點直徑約為2．5 mm，點間隔為1～2 mm）。在恒濕器（相對濕度為82%RH）內室溫放置2 h，用細的濾紙卷吸去抗體殘液，再依次用PBS溶液、超純去離子水清洗數次，氮氣吹干。

將上述吸附有Cy3-羊抗人IgG的 PDMS面朝下，緊貼于另一潔凈的載玻片上，插入生物芯片掃描儀的芯片池，檢測點陣斑點的熒光強度。芯片掃描儀的實驗參數:激發/發射波長分別為543/570 nm，強度為80%，掃描分辨率為10 μm。

1．3 非均相免疫分析

按照1．2節相同的方法制備抗體微陣列，即先將羊抗人IgG（25 mg/L），吸附固定于PDMS表面，形成抗體微陣列。接著用1%BSA溶液室溫封閉過夜（或37℃下封閉2 h），再在各斑點上依次加入不同濃度的人IgG（0．01～100 mg/L）和Cy3-羊抗人IgG溶液（10mg/L），各反應1h。每步反應結束后，均用濾紙吸干溶液，PBS溶液和超純去離子水清洗數次，氮氣吹干。用生物芯片掃描儀檢測斑點熒光強度。非均相免疫反應的過程如圖1。

2 結果與討論

2．1 3D微納結構玻璃陽模和PDMS基片的制備與表征

圖1 微陣列芯片上的非均相免疫分析流程示意圖Fig 1 Schematic diagram of the procedure of heterogeneous immunoassay on microarray chip

以HF為刻蝕劑的化學濕法刻蝕技術常被用于加工玻璃微流控芯片的通道。玻璃含有SiO2，Na2O，CaO和MgO等主要成分，而室溫下CaF2和MgF2的溶度積常數分別為2．7 ×10－11和6．4 ×10－9，因此，HF 刻蝕玻璃過程中產生了難溶化合物CaF2和MgF2。隨著刻蝕的進行，產生的沉淀微粒沉積在通道表面，充當掩模層阻止HF溶液進一步均勻地刻蝕下層玻璃，致使通道表面變粗糙［11～13］。該現象對于芯片毛細管電泳等分離分析是極為不利的，將嚴重影響系統分離的效率。

本文利用上述現象來制備具有3D微納結構的玻璃陽模。研究表明，刻蝕后玻璃表面的粗糙化程度與刻蝕速率、刻蝕時間等有關。HF濃度越大，難溶性氟化物的聚集沉降速度越快。采用濃氫氟酸作刻蝕液，可以快速地在表面形成一定厚度和致密程度的阻擋層，覆蓋在玻璃的上表面。隨著刻蝕的進行，刻蝕液必須穿過這層阻擋層才能進一步刻蝕玻璃表面，結果導致后續的刻蝕速率不均勻，刻蝕后在表面形成了凹凸結構。圖2為不同刻蝕時間（0，5，10，20，30min）下制得的玻璃陽模表面形態圖。由光學顯微鏡CCD圖像（a1～e1）可見，刻蝕后的載玻片表面出現μm級凹凸不平紋路，而且隨著刻蝕時間的增長，表面粗糙度增加，紋路加深加密，這可能是由于刻蝕時間的延長，附著在表面的沉淀阻擋層厚度、致密程度逐漸增加，刻蝕不均勻性也逐漸增加所導致。用原子力顯微鏡進一步對載玻片表面的微區域進行表征分析，結果如圖2中的（a2～e2）所示?？梢?，經過HF刻蝕后的載玻片表面不僅形成μm結構，同時在微結構內還套有nm結構，如果將載玻片表面的μm結構比擬成山脈似的大地皺褶，那么，nm結構就類似于山脈中致密樹林。經過NanoScope 5．31R1軟件計算可知，未刻蝕的載玻片表面比較光滑，粗糙度（Rq）為 1．5 nm，經過 5，10，20，30 min刻蝕后，微區域內的平均粗糙度分別為 7．7，14．6，24．0，37．3 nm。因此，隨著刻蝕時間的增加，玻璃表面 nm結構的粗糙度隨之增加。

澆注法是PDMS芯片最基本的制備方法，以玻璃為陽模澆注PDMS，成型后易脫模。本研究以不同刻蝕程度的玻璃為陽模澆注得到PDMS基片，其光學顯微鏡CCD圖如圖3（a1～e1）所示?？梢?，通過澆注復制得到的PDMS基片表面與陽模一樣具有3D結構。

圖2 經過不同刻蝕時間得到的顯微鏡玻璃陽模表面形態圖（a1～e1）為CCD圖;（a2～e2）為AFM圖;刻蝕條件:濃HF含量≥40%，20℃Fig 2 Morphological images of glass templates by microscope at different etching time（a1 ～e1）CCD images，（a2 ～ e2）AFM images．tching conditions:hydrofluoric acid（HF content of≥ 40%），20℃

圖3 顯微鏡下PDMS基片的表面形態圖（a1～e1）為CCD圖;（a2，b2）分別為HF未刻蝕和刻蝕10 min的玻璃陽模復制所得的PDMS表面AFM圖Fig 3 Morphological images of PDMS templates．（a1 ～ e1）CCD images，（a2，b2）AFM images of PDMS substrate replicated from 0 and 10 min HF etching glass templates

從未刻蝕（平板）和刻蝕10 min的玻璃作陽模所得的PDMS的AFM圖［圖3中的（a2，b2）］計算可知，其粗糙度分別為0．9，8．5 nm。至于復制得到PDMS基片的表面粗糙度總體比玻璃陽模的要小，其原因是多方面的，主要原因可能是:1）兩者的材質硬度不一樣，對AFM檢測時的響應能力不同;2）PDMS混合液的粘度大、浸潤性差，澆注時可能不能完全滲透至微納結構的最底部;3）PDMS澆注成型后會可能會有些自然收縮。

2．2 PDMS表面粗糙度對抗體吸附性能的影響

考察了不同刻蝕時間下陽模所澆注出的PDMS對抗體的吸附能力，結果如圖4所示。顯然，經刻蝕產生的表面微納結構可顯著提高PDMS對抗體的吸附能力，而且隨著刻蝕時間的增加，表面粗糙度增加，對抗體的吸附能力也逐漸增強。與平板PDMS（未經HF刻蝕的玻璃為陽模澆注所得）相比，當刻蝕時間大于10 min，抗體的吸附量可提高5～6倍。PDMS基片上吸附的Cy-3-羊抗人IgG抗體的熒光陣列掃描圖上可以看出，各斑點的熒光強度比較均勻，說明抗體的分布均勻。

此外，從圖中各點熒光強度的誤差線可以看出，刻蝕10 min以內澆注所得的PDMS表面上形成的抗體斑點熒光強度的重現性良好。對于1μg/mL的Cy3-羊抗人IgG，熒光信號強度精密度RSD＜15%（n=15）;當刻蝕時間超過20 min，斑點熒光強度的精密度有所下降，這可能是表面過于粗糙所引起的不均勻性所致。

圖4 PDMS表面粗糙度對抗體吸附量的影響Fig 4 Effect of surface roughness on the amount of antibody immobilized on the PDMS surface．

因此，綜合考慮表面對抗體的吸附能力和重現性，刻蝕時間為10 min的玻璃作PDMS的陽模是一種較理想的選擇。

2．3 PDMS微納表面的非均相免疫分析

以刻蝕10min所得的玻璃為陽模，澆注得到具有3D微納結構的PDMS基片，并將其用于微陣列非均相免疫分析。以人IgG為分析模型，按照1．3節的方法進行免疫反應，結果如圖5所示。研究結果表明，3D結構的PDMS基片較平板PDMS基片免疫反應熒光信號增強，熒光強度為平板PDMS基片上的5倍左右。其中，人IgG濃度在0．01～10 mg/L范圍內，免疫反應所得熒光強度與抗原濃度呈良好的線性相關性，平板和刻蝕10 min澆注所得的PDMS基片上抗原濃度—熒光強度的線性方程分別為

式中y為熒光強度，x為人IgG抗原濃度（mg/L）。

初步實驗表明:3D微納結構PDMS芯片可有效提高免疫分析的靈敏度。

圖5 人IgG微陣列免疫分析結果Fig 5 Result of immunoassay of human IgG microarray

3 結論

采用常規的化學濕法刻蝕技術和軟刻蝕技術相結合，研究建立了一種快速、簡單、高效的抗體微陣列免疫傳感芯片制作方法。這種制作方法不需要特殊的MEMS/NEMS技術，制得的陽模耐用性強，可以重復多次使用。研究結果表明:利用該方法制得的3D微納結構PDMS芯片，可顯著提高抗體的吸附能力和免疫分析方法的靈敏度，所建立的制備方法可為構建高效、高靈敏度的抗體微陣列檢測提供一定的技術保障。

［1］ Figeys D．Adapting arrays and lab-on-a-chip technology for proteomics［J］．Proteomics，2002，2（4）:373 －382．

［2］ Templin M F，Stoll D，Schwenk J M，et al．Protein microarrays:Promising tools for proteomic research［J］．Proteomics，2003，3（11）:2155－2166．

［3］ Henares T G，Mizutani F，Hisamoto H．Current development in microfluidic immunosensing chip［J］．Analytica Chimica Acta，2008，611（1）:17 －30．

［4］ Zhou J W，Ellis A V，Voelcher N H．Recent developments in PDMS surface modification for microfluidic devices［J］．Electrophoresis，2010，31（1）:2 －16．

［5］ Sui G D，Wang J Y，Lee C C，et al．Solution-phase surface modification in intact poly（dimethylsiloxane）microfluidic channels［J］．Analytical Chemistry，2006，78（15）:5543 －5551．

［6］ Wang Y L，Lai H H，Bachman M，et al．Covalent micropatterning of poly（dimethylsiloxane）by photografting through a mask［J］．Analytical Chemistry，2005，77（23）:7539 －7546．

［7］ Vlachopoulou M E，Tserepi A，Petrou P S，et al．Protein arrays on high-surface-area plasma-nanotextured poly（dimethylsiloxane）-coated glass slides［J］．Colloids and Surfaces B:Biointerfaces，2011，83（2）:270 －276．

［8］ Liu C C．Rapid fabrication of microfluidic chip with three-dimensional structures using natural lotus leaf template［J］．Microfluid Nanofluid，2010，9（4 －5）:923 －931．

［9］ Kim S Y，Yu J，Son S J，et al．Signal enhancement in a protein chip array using a 3D nanosurface［J］．Ultramicroscopy，2010，110（6）:659－665．

［10］ Ma D，Chen H W，Shi D Y，et al．Preparation and characterization of thermo-responsive PDMS surfaces grafted with poly（N-isopropylacrylamide）by benzophenone-initiated photopolymerization［J］．Journal of Colloid and Interface Science，2009，332（1）:85 －90．

［11］ He Q H，Chen S，Su Y，et al．Fabrication of 1D nanofluidic channels on glass substrate by wet etching and room-temperature bonding［J］．Analytica Chimica Acta，2008，628（1）:1 －8．

［12］ Lin C H，Lee G B，Lin Y H，et al．A fast prototyping process for fabrication of microfluidic systems on soda-lime glass［J］．Journal of Micromechanics and Microengineering，2001，11（6）:726 －732．

［13］ Iliescu C，Tay F E H．Wet etching of glass［C］∥International Semiconductor Conference，2005，1 －2:35 －44．