眼針對腹瀉型腸易激綜合征模型大鼠結腸組織5-HT表達的影響

王艷杰，張立德，王 健，關洪全，劉旭東，劉慧慧，柴紀嚴，趙金茹，王德山

(遼寧中醫藥大學，沈陽 110032)

近年來對于5-HT與IBS關系的研究已成為熱點。因此本課題組通過建立腹瀉型腸易激綜合征(D-IBS)大鼠模型，并觀察眼針對該模型大鼠結腸組織中5-HT表達的影響，探索眼針對IBS治療的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性Wistar大鼠30只，北京維通利華實驗動物技術有限公司提供(許可證編號SCXK(京)2007-0001)，體重 220g±20g。

1.2 主要試劑和儀器

大鼠 5-HT ELISA試劑盒(美國 ADL公司，Catalogue No:QRCT-301330121013EIA/UTL);兔抗大鼠5-HT抗體(美國 ADL公司)、SABC試劑盒和DAB等(武漢博士德生物工程有限公司)。2010型anthos酶標儀(奧地利安圖斯);RM2235型手動石蠟切片機，EG1150C型包埋機，HI1220型烘片機(德國LEICA)，BX51型OLYMPUS反射熒光顯微鏡(日本OLYMPUS)。

1.3 動物分組、模型建立和評價

30只SPF級Wistar大鼠按照隨機數字法分為正常組、IBS模型組、眼針組3組，每組10只，分籠飼養，標準顆粒飼料喂養7d以適應實驗室環境，然后開始建立D-IBS動物模型。其中IBS模型組和眼針組采用慢性應激結合束縛方法建立D-IBS模型。D-IBS的模型建立和評價參考王艷杰等［1］的報道。以 Katz 等慢性應激法［2］與 Williams等［3］束縛方法結合建立D-IBS模型。在18d中讓大鼠隨機循環接受6種不同的應激刺激，包括:①冷水游泳(14℃，5min);②夾尾(180 s);③禁水(24 h);④禁食(24 h);⑤電擊(電壓為 30 V，電擊 5 s，間歇 5 s，共進行120 s);⑥高溫(溫箱中40℃30min);每天隨機接受1種刺激，18d內平均每種刺激3次，同時每天給予30%水合氯醛(3ml/kg)腹腔注射麻醉，用膠帶束縛前肩、前上肢及胸部，限制其搔抓頭面部，束縛時間1h。觀察大鼠一般狀態、結腸組織病理學、結腸轉運功能和腸道敏感性等變化對模型進行評價。

1.4 眼針治療方法

模型通過評價后，眼針組給予眼針治療每日1次，連續針刺 7d。治療方法參考王德山［4］等的報道。眼針取穴及刺法:用31號13mm毫針，于大鼠眶周2mm處針刺，定位參照人體取穴方法，取下焦區、大腸區、肝區、脾區針刺。通過觸摸大鼠眼周，確定眼眶眶緣的位置，并在標記好的穴區部位，眼眶眶緣上1mm～2mm部位采用斜刺方法進行針刺。具體方法:左眼按照順時針方向(右側按逆時針方向)，從該穴區的起始定位線處斜向下45°角向終止定位線方向進針，刺入真皮，達到皮下組織，進針2mm左右，留針20min。留針期間進行刮柄刺激，在留針10min時，采用刮柄法行針1次，刮針柄5下以加強刺激。

1.5 腸道敏感性(腹部回縮反射)檢測

治療結束后采用腹部回縮反射(AWR)測定大鼠腸道敏感性。實驗前禁食12h，乙醚麻醉狀態下將帶有球囊的導尿管置入距肛門內1cm處并固定于尾部，將大鼠限制在特制的透明塑料籠(20cm×6cm×8cm)內，只能前后運動而不能轉身。清醒30min后向球囊內分別注入溫水擴張結、直腸(CRD)，觀察引起大鼠腹部抬起(結腸擴張時腹肌收縮并抬離桌面)以及背部拱起的壓力閾值(結腸擴張時骨盆抬起，身體呈弓狀)，進行行為評估。

1.6 血清和結腸5-HT含量的變化檢測

治療結束后，20%烏拉坦(5ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠，腹主動脈取血3ml離心分離血清。在取血后，打開大鼠腹腔取結腸組織，用預冷生理鹽水洗去血液，濾紙吸干，按1∶9(結腸組織:生理鹽水，W∶V)加入生理鹽水制備組織勻漿，離心取上清。取血清和上清液按照試劑盒說明書進行ELISA實驗，然后利用全自動酶標儀，在450nm處測定各孔的OD值，采用CurveExpert 1.3進行標準曲線的繪制，并計算出對應的濃度值。

1.7 結腸5-HT表達的變化檢測

利用多聚賴氨酸進行防脫片處理，切片常規脫蠟至水。3%H2O2滅活內源性酶，蒸餾水洗3次。熱修復抗原，冷卻后 PBS洗滌1～2次。滴加5%BSA封閉液，室溫20min。滴加適當稀釋的一抗(1∶100)，4℃過夜。PBS洗2min/3次，滴加生物素化山羊抗小鼠 IgG，20℃ ～37℃孵育 20min。PBS洗5min/2次，滴加試劑 SABC在室溫下孵育 30min。PBS洗5min/4次，DAB顯色，室溫顯色，鏡下控制反應時間。蒸餾水洗滌，蘇木素輕度復染、脫水、透明、封片，顯微鏡觀察并拍照。采用 BI2000醫學圖像分析系統進行圖像分析，選取200倍圖像，觀察結腸黏膜固有層和肌層，細胞質呈棕黃色為5-HT陽性表達細胞，每張切片隨機選取3～5個高倍視野測定平均光密度值，平均光密度值代表陽性表達參數，平均光密度值越大，陽性表達越強。

1.8 統計方法

實驗數據運用SPSS13.0處理，以均數±標準差(珋x±s)表示實驗結果，進行多組數據的方差分析，組間比較采用LSD法。P＜0.05為有統計學意義。

2 結果

2.1 眼針對D-IBS模型大鼠腸道敏感性的影響

表1顯示，與正常組比較，D-IBS模型組背部拱起閾值和腹部抬起閾值均顯著降低(P＜0.01);眼針治療結束后，和D-IBS模型組比較，眼針組背部拱起閾值和腹部抬起閾值均顯著升高(P＜0.01)。

表1 眼針對D-IBS模型大鼠背部拱起和腹部抬起閾值的影響(珋x±s)

2.2 眼針對D-IBS模型大鼠血清和結腸5-HT含量的影響

表2顯示，與正常組比較，D-IBS模型組5-HT水平顯著升高 (P＜0.01);與D-IBS模型組比較，眼針組5-HT水平降低 (P＜0.01)。

表2 眼針對D-IBS模型大鼠血清和結腸5-HT含量的影響(珋x±s)

2.3 眼針對D-IBS模型大鼠結腸組織5-HT表達的影響

圖1顯示，5-HT免疫組化染色呈棕黃色反應，各組標本均可見免疫染色陽性細胞，陽性細胞主要表達在結腸固有層;與正常組比較，D-IBS模型組細胞表現為細胞著色較深，染色強度增強，平均光密度值顯著升高(P＜0.01);而與D-IBS模型組比較，眼針組免疫組化染色強度降低，表現為著色較淺，平均光密度值顯著降低(P＜0.01)。

圖1 眼針對IBS模型大鼠結腸5-HT免疫組化染色強度的影響

3 討論

眼針療法是我院著名老中醫彭靜山先生于1974年開創的一種獨特的針刺療法［5、6］。近 40年來，經千萬病例證實眼針對30余種疾病確有療效，特別對急性腦中風及頑固性疼痛等具有“隨針起效”的顯著療效。彭老是根據中醫基礎理論，結合“五輪八廓”、“八卦”學說創立的眼針療法，他將眼周分為“八區十三穴”，并認為“八區十三穴絡腦通臟腑”，通過觀察穴區白睛脈絡形態和顏色以診斷疾病稱“觀眼識證”，依據“觀眼識證”及臟腑辨證取穴針刺以治療疾病。因此眼針是從整體觀念出發，認為眼與五臟六腑之間依靠經絡的溝通、聯絡具有密切聯系，使全身構成一個有機的統一整體，維持著人體的正常生命活動，若臟腑經絡功能失調，則可影響到眼睛，使眼睛發生各種變化。在眼眶邊緣穴區施針，就可以達到疏通經絡、調整臟腑經絡氣血、平衡陰陽、調節臟腑治療全身疾病的目的。為了進一步探索眼針是如何作用于內臟及其調整胃腸道功能的機制，本課題組提出五臟六腑之精華皆注于目，臟腑功能氣血盛衰均與眼穴相關聯，眼針刺激外周相關穴位，能夠啟動靶器官神經遞質、細胞因子等釋放和分泌，從而調控局部血運與代謝、改善其功能效應，達到治療效果的假說。為了證明這一假說本課題組建立了D-IBS大鼠模型，并采用眼針治療，通過測定結腸組織5-HT的表達變化，來探索眼針的作用機制，從而為豐富眼針的中醫理論基礎內涵提供現代醫學依據。

表3 眼針對D-IBS模型大鼠結腸5-HT免疫組化染色強度的影響(珋x±s)

IBS是一組以腹痛或腹部不適，同時伴有排便習慣改變和(或)大便性狀異常為主要癥狀的腸道功能性疾病。越來越多的研究表明，IBS的發病與精神因素和腸道的刺激因素有關。應激可通過腦-腸軸影響胃腸道的運動、分泌、感覺功能。本實驗采用慢性應激結合急性束縛的方法建立了由精神應激引起的IBS大鼠模型，較好地模擬了人類IBS的重要病因-精神創傷。本實驗在造模過程中，在應激刺激下大鼠逐漸出現躲避、畏懼、嘶叫、激惹及好斗傾向，受刺激時稀便率增加，體重增長率降低，與人類IBS有一定的相似性，說明造模成功。該模型中醫辨證屬于肝郁脾虛型，因此本實驗以整體觀念為理論基礎，以辨證論治為治療原則，結合眼針選穴方法，確定疏肝健脾為治療法則，選取下焦區、大腸區、肝區、脾區為治療腧穴，共奏調理臟腑、平衡陰陽之效。

內臟敏感性增加是 IBS患者基本的病理生理改變。包括便秘型和腹瀉型患者都有腹痛或腹部不適，肛門直腸測壓顯示兩型 IBS患者都存在內臟高敏感性。本實驗結果顯示，與正常組比較，D-IBS模型組背部拱起閾值和腹部抬起閾值均顯著降低，說明模型制備成功;眼針治療結束后，與D-IBS模型組比較，眼針組背部拱起閾值和腹部抬起閾值均顯著升高，說明針刺眼周的相應穴區能夠調控腸道功能，降低腸道敏感性，但其具體機制仍需進一步探討。

5-羥色胺又稱為血清素(serotonin)，來源于色氨酸的代謝，人體大約95%的5-HT來源于腸道，其中90%的5-HT儲存于腸嗜鉻細胞(enterochromaffin cell，EC)中，10%存在于腸神經系統(enteric nervous system，ENS)，且二者均可攝取色氨酸或胺前體在色氨酸羥化酶催化下合成5-HT［7］。外周神經系統的5-HT幾乎全部由位于胃腸腺腔底部的EC產生、貯存和再攝?。?］。近來有報道［9、10］，腹瀉型 IBS 患者的血漿5-HT濃度較健康人明顯增高。與正常組比較，腹瀉型、便秘型 IBS分泌5-HT的 EC細胞數量明顯增多，差異有顯著性。免疫組化染色顯示，IBS組EC細胞內合成的5-HT增加，電鏡顯示腸道EC細胞功能活躍。EC細胞對腸腔內壓力和化學刺激非常敏感，一旦腸腔內壓力升高即可分泌5-HT，作用于黏膜下傳入神經神經元上的5-HT受體，激發蠕動反射并調節腸道分泌功能。臨床上［11］慢傳輸性便秘、IBS、功能性腹脹等胃腸功能性疾病患者常伴有明顯的情緒精神狀態異常，而一些針對5-HT信號系統的抗抑郁藥、抗焦慮藥也能有效緩解IBS，這又從另一個側面提示5-HT在胃腸道功能性疾病中扮演了重要角色。我國學者李兆申等［12］發現與正常組比較 C-IBS、D-IBS腸道分泌5-HT的 EC細胞數量明顯增加，電鏡下見其分泌功能狀態活躍。Spiller等［13］報道 IBS患者的直腸活檢標本中，含5-HT的EC細胞數量增多，可見EC細胞與 IBS的發病有一定的聯系。

本課題的實驗研究結果表明，與正常組比較，DIBS模型組血清和結腸組織5-HT水平顯著升高，說明腹瀉型腸易激綜合征模型大鼠腸道合成和分泌5-HT增多。而眼針治療后，與D-IBS模型組比較，眼針組血清和結腸組織5-HT水平降低，說明通過辨證取穴，針刺眼周下焦、大腸、脾和肝區等穴區能夠調控腸道5-HT的合成和分泌，從而調控腸道功能。本課題實驗結果顯示，各組標本均可見5-HT免疫染色陽性細胞，主要表達在結腸固有層;與正常組比較，D-IBS模型組細胞染色強度增強，表現為細胞著色較深，進一步說明腹瀉型腸易激綜合征模型大鼠腸道 EC細胞數量增加，合成和分泌5-HT增多。而與D-IBS模型組比較，眼針組免疫組化染色強度降低，表現為著色較淺，說明眼針治療能夠減少腸道EC細胞數量，減少5-HT的合成和分泌。因此說明通過辨證取穴，眼針刺激外周相關穴位，啟動了靶器官即腸道的5-HT等神經遞質的釋放和分泌，從而調控了結腸的運動與代謝功能，改善其功能效應，達到了治療效果，為中醫理論中五臟六腑之精華皆注于目，臟腑功能氣血盛衰均與眼穴相關聯，眼針“八區十三穴絡腦通臟腑”提供了現代生物學支撐依據。

［1］ 王艷杰，王德山，關洪全，等.眼針對腹瀉型腸易激綜合征大鼠血清和結腸組織中P物質及血管活性腸肽含量的影響［J］.針刺研究，2010，35(1):8-11.

［2］ Katz R，Roth K，Carroll B.Acute and chronic stress effects on open field activity in the rat:Implications for a model of depression ［J］.Neurosci Biobehav Rev，1981，5:247-251.

［3］ Williams CL，Villar GR，Peterson JM，et al.Stessinduced changes in intestinal transit in the rats:a model for irritable bowel syndrome［J］.Gastroenterology，1988，94:611-621.

［4］ 王德山，王艷杰，張立德.眼針對 IBS模型大鼠結腸組織VIP含量及基因表達的影響［J］.中國中醫基礎醫學雜志，2011，17(3):314-316.

［5］ 董文毅，彭 敏.眼針療法的研究進展［J］.針灸學報，1991，7(3):48-51.

［6］ 彭靜山.眼針療法［J］.中國針灸，1988，8(6):21.

［7］ 李春元.5-HT受體調節劑在腸易激綜合征治療中的作用［J］.世界臨床藥物，2003，24(5):309-310.

［8］ Foxx-Orenste in AE，Kuemmer le JF，Gr ider JR.D ist inct 5-HT receptors mediate the peristaltic reflex induced by mucosal stimuli in human and guinea pig intestine［J］.Gastroenterology，1996，11:1281-1290.

［9］ Heateon KW，O’Donnell LD，Braddon FE，et al.Symptoms of ir2 ritable bowel syndrome in a British urban community:consulters and nonconsulters［J］.Gast roenterology，1992，102:1962-1967.

［10］ Cooke HJ.Neurotransmitters in neuronal refl exes regulating intestinal secretion［J］.Ann N Y Acad Sci，2000，915:77-80.

［11］ Whitehead WE，Palsson O，Jones KR.Systematic review of the comorbidity of irritable bowel syndrome with other disorders:what are the causes and implications?［J］.Gastroenterology，2002，122:1140-1156.

［12］ 李兆申，詹麗杏，鄒多武，等.腸易激綜合征患者分泌 5-羥色胺的腸嗜鉻細胞形態及功能的改變［J］.中華消化雜志，2004，24(2):94.

［13］ Spiller R C，Jenkins D，Thornley JP，et al.Increased rectal m ucosal enteroendocrine cells T lym phocytes and increased gut perm eability follow ing acute C am plobacter enteritis and in post-dysenteric irritable bow el syndrom e［J］.G ut，2000，47(6):804.