艾迪注射液無菌檢查方法的建立

中國人民解放軍總醫院藥品保障中心（100853）王麗華

艾迪注射液由斑蝥、人參、黃芪、刺五加組成。艾迪注射液有清熱解毒、消瘀散結的作用。臨床上用于原發性肝癌、肺癌、直腸癌、惡性淋巴瘤、婦科惡性腫瘤等的治療。近兩年，艾迪注射液在臨床用量較大，從用藥安全出發，本文參照《中國藥典》[1]規定，進行其無菌檢查的建立及驗證試驗，同時采用經驗證確認的方法檢查了3批制劑，為該藥無菌檢查建立科學有效、可行的評價方法提供依據。

1 試驗材料

1.1 供試品 艾迪注射液：5ml/支，批號：080208、080410、080518，貴州益佰制藥股份有限公司。

1.2 培養基 硫乙醇酸鹽流體培養基（批號060215）、改良馬丁培養基（批號060331）、營養肉湯培養基（批號0 7 0 4 0 4）、營養瓊脂培養基（批號070409）、改良馬丁瓊脂培養基（批號060122）、玫瑰紅鈉瓊脂培養基（批號060216），此6種培養基均由中國藥品生物制品檢定所提供。稀釋液為0.9%無菌氯化鈉溶液，沖洗液為pH7.0的氯化鈉-蛋白胨緩沖液。

1.3 培養基、溶劑均按《中國藥典》2005年版附錄[1]中有關規定進行配制、分裝和滅菌；試驗用具、玻璃器皿等均按《中國藥典》2005年版附錄[1]中有關規定進行滅菌，符合無菌檢查要求。

1.4 驗證實驗用菌種（第三代） 包括：①金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]，②銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC（B）10104]，③枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B）63501]，④生孢梭菌（Clostridium sporogenes）[CMCC（B）64941]，⑤白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F）98001]，⑥黑曲霉菌（Aspergillus niger）[CMCC（F）98003]。菌種均由中國藥品生物制品檢定所醫學菌種保藏中心。

1.5 儀器 100級凈化工作臺（北京四達凈化技術研究所）；全自動立式電熱壓力蒸汽滅菌器MLS-3020（日本三洋公司）；電熱恒溫培養箱WMK-08型（湖北省黃石市醫療器械廠）。

2 方法與結果

2.1 菌液的制備

2.1.1 取經35℃培養18～24h的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的肉湯新鮮培養物1ml，加入9ml的0.9%無菌氯化鈉溶液中，10倍系列稀釋至10-5～10-7，制成50～100cuf/ml-1的菌懸液（用營養瓊脂培養基雙碟法計數），備用。

2.1.2 取經35℃培養18～24h的生孢梭菌的硫乙醇酸鹽新鮮培養物1ml，加入9ml的0.9%無菌氯化鈉溶液中，10倍系列稀釋至10-5～10-7，制成50～100cuf/ml-1的菌懸液（用硫乙醇酸鹽培養基中計數），備用。

2.1.3 取經23～28℃培養18～24h的白色念珠菌的改良馬丁新鮮培養物1ml，加入9ml的0.9%無菌氯化鈉溶液中，10倍系列稀釋至10-5～10-7，制成50～100cuf/ml-1的菌懸液（用玫瑰紅鈉瓊脂培養基雙碟法計數），備用。

2.1.4 取經23～28℃培養1周的黑曲霉菌的改良馬丁瓊脂斜面新鮮培養物，用0.9%無菌氯化鈉溶液5ml洗下黑曲霉菌孢子，吸出孢子懸液1ml，加0.9%無菌氯化鈉溶液適量，稀釋至與標準比濁管濁度相當的孢子懸液，比濁后取孢子懸液1ml，用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍系列稀釋至10-5～10-7，制成50～100cuf/ml-1的孢子懸液（用改良馬丁瓊脂培養基雙碟法計數），備用。

2.2 活菌數計數 分別取上述4種細菌菌液1ml加入培養皿，每種菌液做平行2皿，注入營養瓊脂約18～20ml，30～35℃培養48h；分別取上述2種真菌菌液1ml加入培養皿，每種菌液做平行2皿。注入玫瑰紅鈉瓊脂約18～20ml，23～28℃培養72h。細菌和真菌數計數結果見附表1。判斷標準：每lml菌液中含菌量小于100CFU／皿。

2.3 培養基的靈敏度檢查[2]取每管裝有12ml硫乙醇酸鹽流體培養基9支，分別接種上述50～100cfu的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌各2支，每支接種量為1ml，另1支不接種作為細菌空白對照，置規定的溫度培養3天；取每管裝有9ml的改良馬丁培養基5支，分別接種上述50～100cfu的白色念珠菌、黑曲霉各2支，每支接種量為1ml，另1支不接種作為真菌空白對照，置規定的溫度培養5天，逐日觀察結果。以每株菌接種后的培養基不得少于2管呈現生長，對照陰性澄清即無菌生長。試驗結果，該培養基的靈敏度檢查符合要求（見附表2）。

2.4 驗證方法 采用直接接種法[3]。取22ml硫乙醇酸鹽流體培養基13管，分別接入小于100cfu的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌各3管；其中2管接入供試品2ml，另一管作為陽性對照，余1管為空白對照；取22ml改良馬丁培養基7管，分別接入小于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉各3管。其中2管接入供試品2ml，另一管作為陽性對照，余1管為空白對照，所有培養基置規定溫度培養5d（結果見附表3）。

2.5 供試品的無菌檢查 按照驗證過的無菌檢查方法進行3供試品檢查。分取供試品各11支，將每支供試品各取2m1按直接接種法分別加至22ml硫乙醇酸鹽流體培養基及22ml改良馬丁培養基中，并設陽性對照、陰性對照。3批供試品均無菌生長，結果符合規定。

附表1 活菌數計數結果（g/L）

附表2 培養基的靈敏度檢查結果

附表3 艾迪注射液無菌檢查方法驗證

3 討論

3.1 無菌檢查法是對該藥品質量控制的重要檢查項目，《中國藥典》2005年版[1]要求建立藥品的無菌檢查法時要進行方法學驗證，驗證方法主要考慮的是供試品在該試驗條件下有、無抑菌活性。按照《中國藥典》2005年版[1]的要求，以金葡球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉菌作為試驗菌種，對艾迪注射液無菌檢查方法進行了驗證。

3.2 試驗表明，按《中國藥典》規定的樣品檢驗量及檢驗條件下艾迪注射液無干擾因素存在，通過試驗建立的艾迪注射液無菌檢查法——直接接種法，能確實、客觀、簡便地反映該注射液液是否染菌的情況，不必考慮進一步采用稀釋法、薄膜過濾法等方法來消除干擾。驗證試驗結果表明，含供試品各容器中的試驗菌均生長良好，供試品的該檢驗量在該檢驗條件下無抑菌作用，可照此檢查法和檢驗條件進行供試品的無菌檢查。

綜上所述，經方法學驗證，該方法準確可靠，可作為艾迪注射液的無菌檢查法。