氣相色譜法測定飼料中BHT和EQ兩種抗氧化添加劑

上海市農業科學院農產品質量標準與檢測技術研究所 董茂鋒 白 冰 饒欽雄 宋衛國 楊海鋒 趙志輝

2，6-二叔丁基對甲酚 （BHT）和乙氧基喹啉（EQ）是目前應用最廣泛的兩種通用型酚類抗氧化劑（熊中強等，2011）。作為飼料添加劑，其對于改善飼料的品質，防止飼料中維生素等營養成分的氧化變質有重要的作用。由于BHT和EQ組成的抗氧化飼料添加劑具有高濃度含量的特點以及復雜的飼料基質，從而使在檢測過程中按照一般的殘留分析方法不能實現準確的含量測定。近幾年來，對于抗氧化劑的測定，主要有氣相色譜法和液相色譜法（楊曉鳳，2011；李秀勇等，2008；穆同娜等，2008；郭嵐等，2007；胡小鐘等，2000）。 但是對于添加劑中的BHT和EQ分析報道較少，本研究以廣泛的應用性和分析準確性為基礎，通過目前應用廣泛的前處理方式，以及對前處理過程中的條件優化，建立了氣相色譜法測定飼料中兩種抗氧化添加劑BHT和EQ含量的方法。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器 BHT和EQ標準品 （純度≥98%，購于SIGMA），用異丙醇溶解配制為1000 mg/L的標準貯備液，從中分別取一定量的貯備液用異丙醇稀釋成100 mg/L的標準工作液，2～8℃下保存1個月；異丙醇、甲醇、乙腈和丙酮為分析純。超聲儀。

1.2 色譜條件 色譜柱：DB-17ms柱，30.0 m×0.32 mm × 0.25 μm；載氣：N2；流速：2.0 mL/min；升溫程序：100℃保持1 min，然后以15℃/min速度升至210℃，再以40℃/min速度升至260℃保持1.5 min；進樣口溫度：230℃；檢測器溫度：300℃；空氣流量：380 mL/min；氫氣流量：40 mL/min；進樣量：1 μL。

1.3 樣品的制備提取 稱取1.0 g試樣置入150 mL棕色容量瓶中，加入100 mL異丙醇，置于超聲儀中超聲提取4 h，取上清液 （樣品提取液）2 mL，過 0.22 μm 濾膜，裝入進樣小瓶，待測；若樣品中BHT和EQ的含量過高，超出線性范圍，則取上清液1 mL，用異丙醇稀釋，過0.22 μm濾膜，裝入進樣小瓶，待測。

2 結果與討論

2.1 檢出限和線性范圍 從測定標準溶液（S/N＜20的濃度）所得到色譜圖中，以3倍信噪比（S/N＝3）為檢測限（LOD），以 10 倍信噪比（S/N≥10）為定量限（LOQ），計算所得BHT和EQ的檢出限分別為0.015%和0.020%，定量限分別為0.045%和0.06%。

用異丙醇配制一系列標準工作液，BHT和EQ 的濃度分別為 900、600、400、200、100、50、25 mg/L 和 900、600、300、150、75、37.5 mg/L，濃度由低至高進樣測定，以峰面積和質量濃度計算。BHT和EQ的標準曲線和回歸方程見圖1。

2.2 樣品提取溶劑和提取時間的選擇 溶劑作為影響提取樣本中目標化合物的最重要因素，本試驗選取了極性差別較大的5種常規溶劑作為考察對象。稱取混合均勻的飼料抗氧化添加劑0.5 g，分別加入100 mL異丙醇、甲醇、乙腈、丙酮和正己烷5種溶劑，比較BHT和EQ在不同溶劑中提取效果。由于抗氧化添加劑中BHT和EQ的含量比較高，且目標化合物容易被空氣氧化，因此提取時間的長短是影響提取效果的重要因素。

由圖2可見，5種溶劑對BHT和EQ均有一定的提取效果，且在提取4 h后，BHT和EQ的含量不再有較大的變化，但是異丙醇的提取效果最佳。選取異丙醇為提取溶劑時，BHT和EQ的提取含量最高，分別為3.62%和14.00%，而正己烷對BHT的提取效果最差為3.07%，乙腈對EQ的提取效果最差為12.46%。

2.3 提取溶劑體積的優化 除溶劑種類和提取時間外，提取溶劑的體積量也是前處理過程中影響BHT和EQ提取效果的主要因素之一。根據2.1中的結果，選用異丙醇為提取溶劑，提取時間為4 h，考察提取不同提取溶劑體積和稱樣質量比例對BHT和EQ的提取效果的影響，結果見圖3。

保持樣品稱樣量不變，改變異丙醇的體積，4 h超聲提取后，觀察不同異丙醇體積提取的樣品中BHT和EQ的含量。實驗選取了4個考察點，異丙醇和樣品質量的比分別是100，140，200 mL/g和400 mL/g。由圖3可見，樣本中BHT和EQ的含量在4個不同體積和樣品量的實驗設定中，BHT的含量變化范圍為3.10%～3.35%，相對偏差為3.55%，而EQ的含量變化范圍為14.53%～15.04%，相對偏差為1.45%，相對偏差均小于5%。實驗結果表明，當異丙醇提取體積與稱樣量的比例在100～400 mL/g的范圍內，增加異丙醇的提取體積，BHT和EQ的含量無明顯提升，說明對于1.0 g樣品中的BHT和EQ，100 mL異丙醇可完全提取出全部的BHT和EQ。

2.4 方法的準確度和精確度測定 通過上述的前處理提取的優化，確立了1.0 g樣品添加100 mL異丙醇超聲提取4 h的前處理方法，實驗通過3個不同濃度的添加水平以及3個重復實驗驗證方法的準確度和精確度，檢測結果見表1。由表1可見，方法的回收率為77.89%～90.53%，相對標準偏差為2.27%～8.35%。

2.5 BHT和EQ在空氣中的氧化速度測定BHT和EQ的主要作用是防止添加對象中某些易被氧化的物質被氧化，從而延長添加對象的保質期。因此BHT和EQ在接觸空氣過程中，其被氧化的能力和速度成為其作為抗氧化劑的一個重要指標。稱取50.0 g含有一定質量的BHT和EQ樣本放置在表面皿中，放于常溫實驗室內，觀察其在50 d內BHT和EQ的氧化情況。隔一定時間稱取混合均勻的樣品按照已經建立的抗氧化劑中BHT和EQ的檢測方法測定BHE和EQ的含量，結果見圖4。

表1 飼料添加劑中的BHT和EQ的添加回收率測定結果%

由圖4可見，在50 d內，BHT的含量從3.62%降到0.052%，而EQ的含量則從14%降到6.27%。在前7 d，BHT和EQ的氧化速度最快，分別從3.62%和14%降到1.03%和7.4%；在第7天到第28天內，BHT的氧化效果明顯，從1.03%氧化到0.29%，而EQ的氧化效果不明顯，保持在7.23%～7.4%范圍內；第28天到第50天，BHT氧化率為0.08%，而EQ首先在第28天從7.3%快速被氧化到第40天的6.36%后，從第40天到第50天未出現明顯氧化現象。結果表明，BHT和EQ在最初的7 d內被氧化的速度最快，而BHT的被氧化能力明顯高于EQ的被氧化能力，在BHT存在的前提下，EQ能夠在7～28 d和40～50 d的兩個階段保持含量未發生明顯變化。

3 結論

通過對不同提取溶劑、提取時間以及提取溶劑量三方面的考察，建立了合理簡單符合分析化學要求的通過異丙醇超聲提取4 h采用GC-FID測定飼料中BHT和EQ含量的分析方法，為抗氧化劑中的BHT和EQ的含量測定提供檢測分析方法。該方法BHT和EQ方法檢出限分別為0.015%和0.02%，添加回收率為77.89%～90.53%，相對標準偏差為2.27%～8.35%。實驗考察了BHT和EQ在空氣中的被氧化能力，并總結出在暴露空氣室溫條件下，BHT和EQ的氧化規律，為相關的BHT和EQ的作為抗氧化劑使用提供參考。

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