食品中肉類成分種屬鑒別技術研究進展

何瑋玲，黃 明，張 馳*

(1.南京市產品質量監督檢驗院，江蘇 南京 210028；2. 南京農業大學食品科技學院，肉品加工與質量控制教育部重點實驗室，江蘇 南京 210095)

食品中肉類成分種屬鑒別技術研究進展

何瑋玲1,2，黃 明2，張 馳1,*

(1.南京市產品質量監督檢驗院，江蘇 南京 210028；2. 南京農業大學食品科技學院，肉品加工與質量控制教育部重點實驗室，江蘇 南京 210095)

肉與肉制品的摻雜、摻假是食品質量控制面臨的重要挑戰。食品中肉類成分的鑒別與分析技術已逐步形成了分別以蛋白質檢測和以核酸檢測為基礎的方法體系，其鑒別精度可達屬與亞屬水平，檢測靈敏度也達到了納克級。近年來，食品中肉類成分的定量檢測與溯源又成為了本領域中的新研究熱點。本文綜述食品中肉類成分種屬鑒別技術的研究進展，并重點分析應用熒光定量PCR對食品中肉類成分進行定量分析的現狀與前景。

肉制品；摻假；種屬鑒別；定量

肉制品質量安全是全社會共同關注的熱點話題。不法企業使用相對廉價的豬肉、雞肉等肉類原料，通過各種手段的深加工，冒充牛肉、羊肉制品進行銷售以謀取不當利益，這嚴重侵犯了消費者的合法權益。在我國，假冒的牛羊肉卷已多次被媒體曝光；在西方，一項對近千種肉制品的檢測分析表明，有近20%的產品存在標識與品種不完全相符的現象[1]。

傳統的依靠感官與經驗的肉類形態學鑒別手段已遠不能滿足對上述肉制品摻假現象進行控制與監管的需要。近10多年來，應用現代儀器分析與分子生物學方法對食品中肉類成分的鑒別技術不斷發展，鑒別精度與檢測靈敏度均極大提高，已逐步形成了分別以蛋白質檢測和以核酸檢測為基礎的方法體系。近年來，熒光定量PCR(real-time PCR，RTi-PCR)技術的飛速發展又使得對深加工食品中肉類原料的定量與溯源成為可能。本文將分別綜述基于蛋白質檢測與核酸檢測的食品中肉類成分鑒別技術，并特別分析應用RTi-PCR對食品中肉類成分定量分析的現狀與問題。

1 以蛋白質檢測為基礎的肉類本質鑒別技術

從20世紀90年代末至今，大量研究報道了應用免疫學方法對食品中各種動物源性成分的鑒定技術[2-5]，相應的酶聯免疫分析(ELISA)試劑盒與免疫層析試紙條也已面世[3,6]。在抗體方面，牛H-鈣調蛋白抗體是首先用于檢測食品與飼料中牛源性成分的種屬特異性抗體，但由于其對平滑肌以外的組織成分檢測靈敏度較低，因此反芻動物肌鈣蛋白等不具組織特異性的特異性蛋白質逐步取代了H-鈣調蛋白，成為了肉類本質鑒別抗體技術開發的理想靶標[4]。商品化的ELISA試劑盒與免疫層析試紙條等免疫學鑒定技術具有檢測時間短、操作簡便等優勢，但同時也存在著特異性較低、受樣品基質影響大的局限。另外，肉制品中的特征蛋白質會隨著不同加工條件而發生變性，因此需要針對不同變性程度的抗原設計特異性抗體，食品的加工程度極大地影響著免疫檢測試劑盒的選擇性與靈敏度[2-3]。目前，尚未有一種商品化的免疫種屬鑒定方法通過美國FDA或AOAC等權威機構的認證[4-6]。

除免疫學方法外，根據蛋白質分布特征區分動物種屬是食品中肉類本質鑒別的另一思路。利用高效液相色譜(HPLC)法檢測肉制品提取物中組氨酸二肽、肌肽、鵝肌肽和鯨肌肽的分布特征，可有效地對反芻動物來源的肉制品進行鑒定[7]。此外，通過十二磺基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、毛細管凝膠電泳(CE)和等電聚焦電泳(IEF)等電泳技術對肉制品提取物中的蛋白質分布特征進行定性、定量分析，從而鑒別肉類的方法也屢見報道[8-9]。然而，肉制品中蛋白質含量變化范圍廣、干擾因素多，導致此類技術靈敏度較低、易產生假陽性結果，標準化與推廣應用的前景均受到很大局限。

2 以核酸檢測為基礎對食品中肉類種屬的定性檢測

DNA的熱穩定性與酸堿穩定性均優于蛋白質，以動物種屬間遺傳信息的差異作為物種鑒別的檢測靶點具有特異性高、方法便捷、不受組織類別限制等諸多優勢，已逐漸成為食品中肉類成分鑒別的主流方法[1]。在目標基因選擇方面，線粒體基因組DNA序列具有高度的物種特異性，且拷貝數多、在食品加工過程中降解程度低的優點，因此其多態性位點是設計肉類本質鑒定方法的首選靶點；此外，細胞基因組中的重復序列，包括微衛星序列、短散布核元件(SINE)、端粒序列等也是用作物種鑒別的良好靶標；而細胞基因組中的編碼序列由于為單一拷貝，食品加工過程中DNA部分降解后導致檢測靈敏度降低，因此較不宜用于食品中肉類成分的鑒別[1]。

就技術角度而言，DNA探針雜交是最早用于食品中肉類成分鑒定的核酸檢測方法[10]。近十多年來，聚合酶鏈式反應(PCR)技術的迅速發展為物種鑒別開辟的新了途徑，逐步成為了食品中肉類種屬鑒定的核心方法。其基本的實驗思路為：根據不同物種細胞或線粒體基因組序列中的特征位點設計物種特異性引物，利用PCR反應實現食品中目標基因片段的指數級擴增，繼而通過電泳或熒光檢測鑒別食品中可能的物種來源。自從Tartaglia等[11]首先報道了用PCR方法檢測飼料中的牛、羊源性成分至今，大量研究報道了應用PCR擴增、電泳檢測的流程對食品中多種肉類本質的鑒別方法[12-14]，其鑒定靈敏度較蛋白質檢測及DNA雜交提高了1～2個數量級，并實現了在同一PCR反應體系里加入多對引物同時檢測牛、豬、驢、山羊、綿羊、禽類等多種肉類成分的多重PCR鑒定[12-13]，相應的方法也已大量通過認證，進入國際、國內的權威檢測技術標準。

食品中DNA成分復雜，加之PCR技術的高靈敏度，使得應用PCR擴增方法來鑒定物種具有因非特異性擴增而產生假陽性結果的缺點。此外，對于未知基因序列的物種，也難以應用上述的常規思路設計PCR鑒定流程。因此，以PCR為基礎、應用改良的引物設計策略或新型驗證手段的鑒定方法已逐步成為了肉類定性鑒別的新方向。其中，限制性片段長度多態性擴增(PCRRPLF)與隨機擴增多態性PCR(RAPD-PCR)是兩種主要策略：前者將通用引物擴增后的PCR產物進行限制性內切酶酶切，通過物種特異性電泳圖譜進行定性分析[15-17]，可進行不同種的牛肉等親緣性較近的物種間的鑒別[16]；后者針對食品中基因序列未知的肉類成分，采用隨機引物得到PCR產物的指紋圖譜，根據指紋圖間的差別區分不同的種屬[18]。然而，PCR-RPLF的缺點是容易受到目標基因序列中酶切位點隨機突變的影響，易產生檢測結果的不確定性；RAPD-PCR的重復性較差且受到食品中其他DNA成分的嚴重干擾，因此兩者均有不易標準化與廣泛應用的劣勢。此外，PCR擴增后的核酸序列分析也是肉制品組分鑒別的有效方法[19]，但其受制于較高的檢測成本與繁瑣的步驟等缺點，推廣的潛力同樣有限。值得一提的是，Bai Weibin等[20]與Ahmed等[21]分別報道了應用通用引物多重PCR(CM-P-PCR)與環介導等溫擴增(LAMP)對肉制品進行種屬鑒別的技術，這些研究通過對PCR擴增方案的巧妙構思與設計，在確保PCR鑒定高靈敏度的前提下，有效抑制非特異性擴增，減少假陽性檢測結果，是應用基因擴增技術進行肉類成分定性檢測卓有成效的新思路。

近5年來，實時熒光定量PCR技術開始應用于食品中的肉類鑒別，并在提升了定性檢測準確性的基礎上使得定量檢測成為可能。RTi-PCR是利用PCR反應體系中熒光信號的變化對產物生成進行實時監測的技術，應用最廣泛的RTi-PCR技術包括兩類：利用雙熒光標記探針的熒光基團解離產生熒光強度變化的TaqMan RTi-PCR，以及利用染料分子插入雙鏈DNA產生熒光變化的SYBR Green RTi-PCR。在定性檢測方面，TaqMan RTi-PCR技術通過TaqMan探針與模板的結合與水解，相比于常規PCR檢測，極大改善了反應特異性，使得同一反應中多種肉類的同時鑒別的可靠性大大提升[22-23]；SYBR Green RTi-PCR可生成單個PCR循環的溶解曲線，可根據曲線的溶解溫度進行種屬的定性檢測[24]。總之，RTi-PCR憑借其特異性好、檢測自動化程度高等優勢，在肉制品種屬鑒別上具備良好的標準化與應用前景。對于目前較常使用的幾種肉類成分檢測技術，其特點和存在問題比較見表1。

表1 幾種肉類成分檢測技術的比較Table 1 Comparison of several detection technologies for meat ingredients

3 應用RTi-PCR對食品中肉類成分的定量與溯源

在RTi-PCR反應中，熒光信號到達設定域值時所經歷的循環數Ct與模版拷貝數的對數呈線性關系，因此RTi-PCR是模版DNA定量的有效方法。應用RTi-PCR技術對食品中肉類成分進行定量研究也屢見報道[25-29]，無論使用 TaqMan RTi-PCR[22,27,29]還是SYBR Green RTi-PCR[25]，均可通過繪制Ct值與模板量的標準曲線對起始目標基因進行定量，進而結合核酸提取效率等因素推算出樣品中特定原料肉的添加量及添加比例。應用RTi-PCR不僅可對食品中牛肉、豬肉、羊肉、雞肉等不同種類的成分進行定量與溯源，而且可利用TaqMan探針5＇端首個堿基差異實現單堿基突變或缺失的檢測，從而對混合肉類中親緣關系很近的成分如紅鹿、馬鹿、獐鹿肉進行區別與定量[28]。

盡管近年來應用RTi-PCR的肉類成分定量技術有了長足發展，但相關方法的完善與推廣仍面臨著諸多挑戰。首先，在目標基因選擇方面，線粒體基因組編碼序列雖然是肉類定性鑒別的首選，但不同動物組織中線粒體數量區別較大，在動物組織種類未知的情況下以之作為定量檢測的目標基因，則可能導致定量結果的偏差，而現有的部分研究卻未考慮這一因素[22]；細胞基因組中的重復序列不存在組織差異，但重復序列間的高同源性加大了特異性引物與探針設計的難度；細胞基因組中單拷貝的編碼序列在食品加工過程中降解嚴重，導致檢測靈敏度過低而不適于定量研究。因此，如何更好地選擇高保守性、多拷貝、低降解程度且組織差異小的目標基因設計物種特異性引物和探針，將是食品中肉類成分RTi-PCR定量技術改進面臨的首要問題。

其次，食品加工過程導致細胞內DNA大量降解，使用RTi-PCR對模板DNA的定量結果必須結合DNA的降解程度才能推算出食品中原料肉的用量。經過不同處理過程的熟制食品中DNA降解程度可相差10倍以上[27]。針對這個問題，Laube等[27]在RTi-PCR反應體系中同時加入myostatin基因特異性引物與探針，構建二重的myostatin校正系統。由于myostatin基因在不同哺乳動物及禽類組織中的表達水平相當，因此將對myostatin基因的定量結果與生肉組織中的定量結果相比，即可計算出基因組DNA的降解程度，從而進一步通過降解程度校正物種特異性擴增的定量結果。

再者，PCR反應易受到酶抑制劑的影響導致定量結果的偏差。加入已知濃度的陽性內參(IPC)構建二重反應體系是校正酶抑制劑影響的有效方法。IPC往往是人為重組的質粒或線性DNA片段，體系中同時存在擴增IPC的引物與探針，可通過對IPC擴增Ct值的變化反映PCR反應的抑制程度并加以校正[30]。然而時至今日，尚未見使用myostatin與IPC系統的三重擴增體系同時校正DNA降解與反應抑制的肉類RTi-PCR定量研究報道。

此外，DNA提取效率、食品自身狀態、儲存時間、檢測儀器性能等因素均會對應用RTi-PCR的肉類成分定量產生影響。總之，盡管現有研究已報道了諸多深加工食品、混合肉制品中肉類成分定量的成功案例，但相關方法仍處于不斷改進、優化與完善之中。

4 結 論

食品中肉類成分的種屬鑒定技術是打擊肉制品摻假、維護市場秩序的有效保障。通過檢測特征蛋白質或其分布的肉類鑒別技術已逐步被更靈敏實用的核酸檢測所取代。如今，熒光定量PCR技術的飛速發展為肉類成分檢測開辟了新的途徑，使得食品中肉類成分的定量分析與溯源成為可能。在定量檢測中，通過對反應體系的精巧設計而提升方法的準確性與實用價值將成為相關技術的發展方向與趨勢。

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Recent Technological Advances for Identification of Meat Species in Food Products

HE Wei-ling1,2，HUANG Ming2，ZHANG Chi1,*
(1.Nanjing Institute of Supervision and Testing on Product Quality, Nanjing 210028, China；2. Key Laboratory of Meat Processing and Quality Control, Ministry of Education, College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095, China)

Meat adulteration is one of the worldwide challenges for food quality control. In the last decade, identification technologies for meat species in food products have been mainly focused on specific proteins or DNA sequences. The precision of analysis has been at the genus or subgenus level, and the sensitivity of detection has reached up to the nanogram grade.Recently, more attention has been paid to the quantitative analysis of meat ingredients in foods. In this paper, recent technological advances for the identification of meat species in food products are reviewed. Moreover, some current potential quantitative technologies such as real-time PCR are discussed.

meat products；adulteration；species identification；quantification

TS207.3

A

1002-6630(2012)03-0304-04

2011-03-06

國家質檢總局科技計劃項目(2010QK178)

何瑋玲(1987—)，女，碩士研究生，研究方向為肉類質量與安全控制。E-mail：2010108020@njau.edu.cn

*通信作者：張馳(1978—)，男，工程師，博士研究生，研究方向為生物化學與分子生物學。E-mail：cavy78@gmail.com