高壓微射流處理對大豆分離蛋白構象及功能特性的影響

沈 蘭，王昌盛，唐傳核*

(華南理工大學輕工與食品學院，廣東 廣州 510640)

高壓微射流處理對大豆分離蛋白構象及功能特性的影響

沈 蘭，王昌盛，唐傳核*

(華南理工大學輕工與食品學院，廣東 廣州 510640)

通過測定溶解度、乳化性、疏水性和運用差示掃描量熱儀分析(DSC)和圓二色光譜(CD)分析探討不同壓力微射流處理(HPM)對大豆分離蛋白(SPI)構象和功能特性的影響。HPM誘導不溶性蛋白聚合物解聚，增加SPI的溶解度、乳化活性指數和疏水性。DSC圖譜結果表明，處理后的SPI變性溫度基本維持不變，但變性焓值呈現下降趨勢。CD光譜分析表明，HPM對SPI的二級、三級結構沒有明顯的影響。

大豆分離蛋白；高壓微射流；功能特性；構象

大豆蛋白以其較高營養價值和獨特的功能特性，已經成為目前世界上最大的具有商業價值的植物蛋白。隨著我國經濟建設的飛速發展，人們生活水平的日益提高，大豆蛋白常作為添加劑來改善食品的品質，在食品、醫藥保健食品、嬰兒食品和飲料食品等領域得到越來越廣泛的應用。然而，商用大豆蛋白的功能特性通常較差，很大程度地限制了其應用范圍[1]。

高壓技術被認為是一種環境友好的物理改性手段，目前有高壓微射流、高靜壓和傳統動態高壓處理。在樣品高壓微射流處理過程中，高速流動的蛋白質溶液快速通過具有一定幾何形狀的腔體，物料同時受到高速剪切、高頻振蕩、空穴效應和對流撞擊等機械力作用和相應的熱效應，由此引發的機械力化學效應可誘導生物大分子物理、化學及結構性質的變化[2]。由于其處理的時間短，溫度低，效果獨特，被認為是很有發展前景的一種低溫物理加工方法[3]。Sathe[4]利用動態超高壓微射流技術制備了亞微米級的乳狀液；Iordache等[5]探討了高壓微射流處理對變性乳蛋白質溶液粒徑、功能特性以及解聚行為的影響，研究表明高壓微射流處理可以降低蛋白質的粒徑，誘導不溶性聚集物解聚，改善蛋白溶解特性。基于此，研究高壓微射流處理對大豆分離蛋白(SPI)功能特性和構象的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆粕 山東禹王有限公司；大豆色拉油(食品級)中糧食品營銷有限公司；牛血清白蛋白(BSA) Fitzgerald公司；其他化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

M-110EH高壓微射流納米均質機 美國Microfluidics公司；F-7000熒光分光光度計、CR22G高速冷凍離心機日本Hitachi公司；MOS-450圓二色光譜儀 法國Bio-Logic公司；2501PC紫外-可見分光光度計 日本島津公司；Q100差示掃描量熱儀 美國TA Insruments公司；IKAT25高速分散機 德國IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 大豆分離蛋白(SPI)的制備

大豆分離蛋白(SPI)的制備采用經典的堿提-酸沉工藝[6]，并稍作改動。稱取100g大豆粕粉分散于1.5L去離子水(1∶15，m/V)中，用2mol/L NaOH溶液調pH值至8.0，在室溫下攪拌2h，離心(8000×g，30min，4℃)，棄其沉淀物。將上清液pH值調到4.5，離心(5000×g，20min，4℃)。棄其上清液，所得沉淀物經兩次水洗(pH4.5)后，分散于適量的去離子水中，調pH值至7.5。充分溶解后置于去離子水透析24h，冷凍干燥后于－20℃貯存備用。

1.3.2 高壓微射流處理

稱取一定量的SPI溶解于去離子水中，配成5g/100mL的SPI溶液。采用高壓微射流納米均質機，對其進行均質處理，分別于0、40、80、120、160MPa條件下循環均質3次。處理后的蛋白溶液冷凍干燥，－20℃貯存備用。

1.3.3 溶解度測定

將不同壓力處理的樣品分別配成1.0g/100mL不同pH值的蛋白溶液，pH值范圍設置為2.0～10.0。充分溶解后，離心(10000×g，30min，15℃)[7]。上清液進行適當稀釋后，采用Bradford法測定蛋白質含量，以牛血清白蛋白(BSA)為標準物做標準曲線。SPI的溶解度表示為上清液蛋白質量濃度占總蛋白質量濃度的百分比。樣品在0.1mol/L NaOH溶液中的溶解度記為總蛋白質量濃度[8]。

1.3.4 乳化特性測定

在測定小燒杯中分別加入15mL 0.1g/100mL蛋白質溶液(pH值分別為3.0、5.0、7.0、9.0)和5mL玉米油，利用高速分散機經24000×g處理1min后，從測試管底部取出50μL乳液，用0.1g/100mL的SDS稀釋100倍(5mL)，于500nm波長處測其吸光度A500nm。

乳化活性指數(emulsifying activity index，EAI)和乳化穩定性指數(emulsifying stability index，ESI)的計算公式分別如下[9]：

式中：A0為吸光度；DF為稀釋因子，DF=100；ρ為蛋白質量濃度/(g/mL)；φ為光程(φ=0.01m)；θ為油相所占分數(θ=0.25)；A0、A10分別為0min和10min時在500nm波長處的吸光度。

1.3.5 表面疏水性測定

將一定量待測蛋白樣品溶于10mmol/L磷酸緩沖液(pH7.0)中，配制成質量濃度為1.5g/100mL蛋白質溶液。分別移取10、20、30、40、50μL的蛋白溶液加入到4mL的磷酸緩沖溶液(pH7.0)中。在測試前添加20μL 8mmol/L ANS儲備液，振蕩均勻，在室溫下反應8～15min。樣品的熒光強度(fluorescence intensity，FI)采用熒光分光光度計測定。測試條件為：激發和發射波長分別390nm和470nm，激發和發散狹縫寬均為5nm。以蛋白質量濃度為橫坐標，相應的FI為縱坐標做圖，其斜率即為蛋白質的疏水性指數H0。

1.3.6 熱學特性分析

熱學特性用差示掃描量熱儀分析測定。稱取約2mg蛋白樣品置于鋁盒中，加入10μL 10mmol/L磷酸緩沖溶液(pH7.0)充分攪勻后壓盤。以空鋁盒為對照，溫度掃描范圍：30～120℃；升溫速率：5℃/min；保護氮氣流速：50mL/min。采用Theunivers2000分析軟件計算蛋白質的熱力學參數，其中，to為起始變性溫度；td為最大變性溫度；t1/2為半峰寬；ΔH為變性焓。結果為3次測量的平均值。

1.3.7 構象分析

樣品的構象變化采用圓二色光譜儀進行測定。將掃描波長設定190～250nm遠紫外區域，用于研究不同蛋白樣品的二級結構。稱取5mg蛋白樣品溶于5mL磷酸緩沖溶液(10mmol/L，pH7.0)，充分攪拌均勻后于10000×g離心10min。將上清液稀釋至0.1mg/mL，用于二級結構的測定。所用樣品池的光徑為2mm，測量溫度設為25℃，測定時所用的分辨率為0.5nm，掃描速度為100nm/min，靈敏度為100(m·deg)/cm，實驗值為3次掃描的平均值。

將波長設定于250～320nm近紫外區域可用于蛋白質的三級結構的測定。配制蛋白質量濃度為1mg/mL，充分攪拌均勻后于10000×g離心20min，取上清液用于三級結構的測定。所用樣品池的光程為10mm，測量溫度設為25℃，測定時所用的分辨率為0.5nm，掃描速度為100nm/min，靈敏度為100(m·deg)/cm，實驗值為3次掃描平均值。

2 結果與分析

2.1 大豆分離蛋白的溶解度

圖1 高壓微射流處理后大豆分離蛋白的溶解度-pH值變化曲線Fig.1 Protein solubility-pH curves of HPM-treated SPIs

溶解性是蛋白質水化作用的重要體現。溶解性數據對天然來源蛋白質的提取、純化和分離條件的確定至關重要，為蛋白質的可應用性提供一個良好的指標[1]。從圖1 可以看出，高壓微射流處理可以改善蛋白質的溶解特性，這種改善依賴于所施加的壓力及pH值。在各pH值條件下樣品的溶解度均隨著壓力的增加而增加。在酸性條件下改善程度并不明顯，但在堿性條件下，0～80MPa范圍內溶解度增加幅度較大，80～160MPa范圍內的改善程度則與酸性條件下類似，變化很小。胡寶松等[3]運用超高壓射流在0～140MPa內研究SPI的功能性質時，發現pH8的條件下，SPI的溶解度在0～80MPa條件下變化較大，而在80～140MPa條件下溶解度變化很小，這與該實驗結果是一致的。尹壽偉等[2]采用高壓微射流研究蕓豆分離蛋白也得出了類似的結論。這可能是因為0～80MPa條件下，高壓微射流的高速剪切處理使SPI的不溶性聚集體解聚，使之成為更小的蛋白膠團顆粒，從而增大了SPI與水的接觸面積；另一方面，SPI的立體結構變得松散，蛋白質分子有一定程度的解離和伸展，從而暴露出更多的極性基團，因此溶解度也得到改善。而在80～160MPa條件下，由于大量活性基團的暴露，使得蛋白質分子間又相互形成新的化學鍵，導致溶解度變化不大。

2.2 大豆分離蛋白乳化特性

蛋白質的乳化特性與其溶解度、表面疏水性和表面電荷分布相關。在蛋白質溶解度較低的情況下，溶解度是決定蛋白質乳化特性的主要因素；而在蛋白質溶解度較高的情況下，表面疏水性是決定蛋白質乳化性的主要因素[10]。

圖2 高壓微射流處理大豆分離蛋白在不同pH值條件下的EAI(A)和ESI(B)Fig.2 Effect of HPM treatment on EAI and ESI of SPI

蛋白質的乳化特性可通過乳化活性指數(EAI)和乳化穩定性指數(ESI)來表征[2]。樣品的EAI和ESI與pH值的關系如圖2A、B所示。從圖2A可以看出，同一pH值條件下，EAI隨著壓力的增高而顯著增大，這主要歸因于高壓微射流使蛋白質分子結構松散，暴露出更多的親水性基團，使得親水性提高；與此同時分子內部的疏水基團也暴露出來，親油性也增強，兩者達到較好的平衡[11]。

ESI則在酸性條件下變化不明顯，在pH7.0和pH9.0下經高壓微射流40MPa和80MPa處理后有顯著的增加，隨后隨著壓力的升高有下降的趨勢(圖2B)。Wang Xiansheng等[12]研究高壓對SPI的功能性質的影響時則發現，樣品經200～600MPa超高壓處理后，其ESI呈現出下降趨勢，與本實驗數據相吻合。這可能是由于在中性或堿性條件下，超過某一臨界壓力后，由于蛋白質分子的聚集導致柔曲性降低。而柔曲性是影響乳化穩定性的一個重要因素[13]。

此外，EAI對pH值具有依賴性。由圖2A可以看出，在pH5.0處(等電點附近)，EAI最低(16.9～26.7m2/g)，而在偏離等電區域EAI則迅速增加，在pH9.0處，其EAI可達46.7～66.4m2/g，這表明蛋白質的乳化性與蛋白質的溶解度呈正相關。

2.3 大豆分離蛋白表面疏水性和DSC變性參數

圖3 高壓微射流處理對大豆分離蛋白的表面疏水性影響Fig.3 Effect of HPM treatment on H0 of SPI

圖3為高壓微射流處理對大豆分離蛋白疏水性的影響。在較低壓力處理(0～80MPa)和較高壓力處理(80～160MPa)后，蛋白的表面疏水性與處理壓力均呈線性相關性。在高于80MPa處理的樣品，表面疏水性變化顯著，呈急速上升的趨勢。這可能是因為在0～80MPa范圍內，蛋白分子逐漸展開，導致內部疏水基團部分外露，H0開始緩慢增加；而隨著壓力的增加，在80～160MPa范圍內，蛋白分子展開得更加完全，導致H0急速上升。Molina等[14]采用超高壓手段研究7S球蛋白、11S球蛋白和SPI時，發現0.1～200MPa范圍內，這3種蛋白的H0均呈現出上升趨勢；Wang Xiansheng等[12]采用超高壓處理SPI時，得出了同樣的結果。這與本實驗結論是一致的。

圖4 典型的SPI熱變性DSC圖譜Fig.4 Typical DSC thermogram of SPI

由圖4可知，在75℃和90℃處有兩個峰，分別對應著7S和11S球蛋白的變性溫度。SPI中的11S球蛋白在不同的壓力水平(0～160MPa)高壓微射流處理后具有相似的變性溫度(td)，表明SPI結構比較緊湊[15-17]。變性焓變(ΔH)主要用來反映蛋白的變性程度[18]，隨著壓力的增加(0～160MPa)，SPI的變性焓變顯著下降(表1)，這表明不同壓力促使蛋白分子發生不同程度的展開進而發生部分變性。Puppo[19]、Wang Xiansheng[12]等均發現SPI經200～600MPa處理后，ΔH會顯著下降，甚至下降為0。這進一步說明，壓力可以使蛋白分子展開甚至完全展開，從而導致蛋白部分變性或者完全變性。

表1 高壓微射流處理的大豆分離蛋白和對照蛋白的DSC參數Table 1 Thermal transition properties of native and HPM-treated SPIs

2.4 大豆分離蛋白圓二色譜(CD)光譜分析

圖5 大豆分離蛋白遠紫外(A)和近紫外(B)圓二色光譜圖Fig.5 Far- and near-UV CD spectra of SPI

對照和高壓微射流處理樣品的遠近紫外區域圓二色光譜如圖5A、B所示。圖5A表明，樣品在210～220nm處有一較寬的負峰，在196nm處存在一個明顯的正峰，這表明大豆分離蛋白的二級結構以β-類結構為主[20]。

近紫外區域圓二色光譜進一步揭示了大豆分離蛋白三、四級構象。在近紫外區域(250～320nm)，CD信號主要源于芳香族氨基酸，每種芳香族氨基酸有其特征的圖譜，色氨酸(Trp)的吸收峰主要在290nm，在290～305nm具有精細結構；而酪氨酸(Tyr)的吸收峰在275～282nm之間；苯丙氨酸(Phe)殘基具有弱蛋白尖銳的峰，其精細結構在255～270nm范圍[21]。蛋白近紫外區域CD光譜光譜圖形狀主要取決于蛋白中所含的芳香族氨基酸總類、流動性以及其微環境(氫鍵，極性基團和極化度)[21]。由圖5B可知，大豆分離蛋白的近紫外-CD光譜呈現出一個主要的正峰在275nm處，為酪氨酸的特征峰。在所施加的壓力(0～160MPa)范圍內，高壓微射流處理后樣品遠近紫外區域圓二色光譜相似，表明高壓微射流處理對大豆分離蛋白的二、三、四級構象影響甚微。尹壽偉等[2]運用高壓微射流處理蕓豆分離蛋白同樣發現，高壓微射流處理對蕓豆分離蛋白的二級構象無顯著影響。

3 結 論

3.1 高壓微射流處理均能不同程度改善各pH值條件下SPI的溶解度，而且堿性條件下的提高程度高于酸性條件下。

3.2 高壓微射流處理顯著改善了SPI的EAI，而ESI則呈現出先上升后下降的趨勢。SPI的EAI與其溶解度呈現正相關性。在pH5.0(等電點附近)，乳化活性指數最低，而偏離等電區域乳化活性指數迅速增加，在堿性條件下，大豆分離蛋白乳化活性指數高達66.4m2/g。

3.3 表面疏水性和DSC圖譜表明，0～160MPa高壓微射流處理可以使蛋白分子展開，使蛋白發生部分變性；圓二色光譜結果表明高壓微射流處理對于維系蛋白二級、三級結構的次級相互作用力沒有明顯影響。

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Effect of High Pressure Microfluidization on Functional and Conformational Properties of SPI

SHEN Lan，WANG Chang-sheng，TANG Chuan-he*
(College of Light Industry and Food Sciences, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China)

The effect of high pressure microfluidization (HPM) on functional properties and conformational properties of soy protein isolated(SPI) was investigated by measuring solubility, emulsification, hydrophobic properties, DSC thermogram and UV-CD spectrum. HPM could cause insoluble aggregates to dissociate, thus improving the solubility, emulsifying activity index(EAI) and hydrophobic properties of SPI. DSC analysis indicatedTd remained basically unchanged, but ΔHtended to decline.UV-CD spectrum analysis showed that both the tertiary conformation and secondary structure of SPI were nearly unaffected by HPM treatment.

soy protein isolated (SPI)；high pressure microfluidization；functional properties；conformation

TS201.2

A

1002-6630(2012)03-0072-05

2011-03-02

國家自然科學基金項目(30972049)

沈蘭(1986—)，女，碩士研究生，主要從事植物蛋白研究。E-mail：slflesy@126.com

*通信作者：唐傳核(1973—)，男，副教授，博士，主要從事植物蛋白研究。E-mail：chtang@scut.edu.cn