訶子多酚的純化及其油脂抗氧化作用

高云濤，李曉芬，戴建輝，貝玉祥

(云南民族大學化學與生物技術學院，民族藥資源化學國家民族委員會-教育部重點實驗室，云南 昆明 650500)

訶子多酚的純化及其油脂抗氧化作用

高云濤，李曉芬，戴建輝，貝玉祥

(云南民族大學化學與生物技術學院，民族藥資源化學國家民族委員會-教育部重點實驗室，云南 昆明 650500)

以訶子為原料，考察7種大孔樹脂柱純化對訶子多酚的純化效果，AB-8大孔樹脂吸附和解吸效果最佳，柱條件為：流速3.0BV/h，pH6.0，柱溶液質量濃度＜2.0mg/mL，80%乙醇洗脫劑，解吸速度為2.0BV/h，洗脫劑用量3.0BV，最佳柱條件下制得的訶子多酚含量為78.4%。訶子多酚對豬油和菜籽油的抗氧化及與檸檬酸復配協同增效作用實驗表明：訶子多酚可顯著降低豬油和菜籽油的過氧化值，當復配物中訶子精多酚與檸檬酸組成為4∶1，復配物加入量為0.04%時，油脂抗氧化作用最佳，訶子多酚及與檸檬酸復配物具有良好的脂質過氧化抑制作用。

訶子多酚；大孔樹脂；純化；油脂；檸檬酸；抗氧化

油脂自由基氧化導致酸敗是食物變質的主要原因[1-2]，添加抗氧化劑是防止脂肪氧化的有效手段，傳統的抗氧化劑主要以人工合成為主，從天然植物中尋找安全的抗氧化劑已成為研究熱點[2-4]。

訶子(Terminalia)為使君子科欖仁樹屬植物訶子及其變種絨毛訶子的干燥成熟果實[5-7]，是藏藥和蒙藥中最為常用的藥物之一，在藏藥學經典著作《品珠本草》訶子被稱為“藏藥之王”，具有抗氧化、抗菌、解毒、護肝等功效。訶子富含植物多酚[8]，植物多酚具有良好的抗氧化作用及多種生理活性[9-12]。本實驗利用大孔吸附樹脂純化法[13-15]制備訶子多酚，研究訶子多酚油脂抗氧化作用，考察訶子多酚與檸檬酸復配物協同抗氧化作用，并與茶多酚進行比較研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

訶子購自昆明菊花村中藥材批發市場，產地云南臨滄，干品，使用前粉碎至80目；菜籽油購自昆明市糧油市場，機榨油，未經處理直接使用；豬油使用超市購買的板油加工制得，置于冰箱4℃保存。

茶多酚(含量為94.2%) 四川碧馥生物科技有限公司；檸檬酸、沒食子酸標準品(批號：1100831-200302)中國藥品生物制品檢定所；卵磷脂溶液(6.7mg/mL)、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖溶液(PBS，0.1mol/L，pH7.4)；2-硫代巴比妥酸(TBA，1g/100mL)、三氯乙酸(TCA，28g/100mL) 國藥集團化學試劑有限公司。

大孔吸附樹脂(型號為D4020、D3520、X-5、NKA-II、NKA-9、S-8及AB-8) 天津南開大學化工廠。

1.2 儀器與設備

AS10200AD 超聲清洗器(容積330cm×270cm×290cm，體積 10.0L，頻率40/60kHz，實驗使用超聲頻率為 60kHz，輸出功率 320W) 天津奧特賽恩斯儀器有限公司； RE-52AA 旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠；UV-7502PC 分光光度儀 上海尤尼柯有限公司。

1.3 方法

1.3.1 訶子多酚粗提物制備

訶子以60%乙醇溶液超聲提取3次，料液比為1∶20，超聲時間每次60min，抽濾，將濾液旋轉蒸發濃縮除去溶劑，用正己烷萃取除去脂肪，再分別用乙醇、乙酸乙酯和丙酮萃取3次，合并萃取液旋轉蒸發，固體真空低溫干燥至恒質量，即得訶子粗多酚提取物，稱取適量浸膏用無水乙醇配制成一定質量濃度的訶子粗多酚溶液，待用。

1.3.2 訶子多酚大孔樹脂純化

1.3.2.1 靜態吸附實驗

準確稱取預處理后的7種型號樹脂各1.0g，分別置于150mL具塞錐形中，加入20.0mL質量濃度為1.3288mg/mL訶子多酚粗提液，置于恒溫搖床，100r/min振蕩24h，測定上清液中訶子多酚質量濃度，計算吸附量(Qe)和吸附率。將吸附后的樹脂過濾，再各加入50.0mL無水乙醇，振蕩解吸24h，測定解吸液中多酚質量濃度，計算解吸量和解吸率，通過吸附率和解吸率篩選出適合訶子多酚分離純化的樹脂。

1.3.2.2 動態吸附和解吸附實驗

取經過靜態實驗篩選出的樹脂20.0mL，預處理后裝入玻璃層析柱中，將一定質量濃度的訶子多酚提取液通入樹脂，控制流速，分部收集流出液，根據流出液總體積和吸附前后訶子多酚質量濃度差計算動態吸附率。分別考察上柱速率、上柱料液pH值及質量濃度對樹脂吸附訶子多酚的影響，確定吸附條件。按最佳吸附條件進行吸附，吸附完全后，用選定的解吸溶劑進行洗脫。分部位收集流出液，測定其中訶子多酚質量濃度，計算解吸率。考察解吸溶劑質量濃度，確定解吸附條件。

根據動態吸附條件、解吸附實驗獲得的柱條件進行吸附解吸，收集洗脫液，蒸發濃縮除去溶劑，真空干燥至恒質量，即得訶子精多酚提物，臨用前稱取適量以無水乙醇配制成一定質量濃度的訶子精多酚溶液待用。

1.3.2.3 訶子多酚質量濃度的測定

取一定量的植物多酚提取物。用酒石酸亞鐵比色法[15-16]測定多酚的含量，以100mg/L沒食子酸為標準品溶液，測定波長540nm處的吸光度，繪制沒食子酸標準溶液質量濃度(ρ)與其吸光度的標準曲線，回歸方程為：A=0.0179ρ－ 0.002(r=0.9998)。

1.3.3 過氧化值的測定

稱取一定質量濃度的訶子多酚或其復配物配制成溶液，加入100g菜籽油或新鮮豬油中，將振蕩使其充分混勻，放置于60℃的恒溫箱里，定時測定油的過氧化值(POV)。過氧化值的測定采用GB/T 5538—1995《油脂過氧化值測定》[17]推薦的碘量法測定，同時進行空白實驗，并以茶多酚為對照進行對照實驗。

1.3.4 對脂質過氧化抑制活性的測定

以卵磷脂脂質體為模型，硫代巴比妥酸(TBA)吸光度法[15]測定，取0.5mL 6.7mg/mL卵磷脂溶液，加入pH7.4 PBS緩沖液1.0mL，不同質量濃度的樣品溶液1.0mL，2.5mmol/L EDTA-Fe(Ⅱ) 1.0mL，混勻后于37℃水浴中反應45min，再加入28g/100mL的TCA 2.0mL，1g/100mL的TBA1.0mL，混勻后置于100℃沸水浴中加熱10min，冷卻后在532nm波長處測定吸光度，用PBS緩沖液調零，空白管用PBS緩沖液代替樣品測吸光度。計算抑制率。

2 結果與分析

2.1 訶子多酚大孔樹脂的選擇及柱參數測定

由圖1可知，7種大孔樹脂以 S-8的吸附量最高，吸附率98.11%，AB-8次之，為69.76%。AB-8解吸率最高，為 84.20%，而S-8的解吸率不足6.74%。由此可以看出，AB-8大孔樹脂不僅吸附量較大，而且容易被解吸，回收率高。因此，選擇AB-8大孔樹脂為訶子多酚純化材料。

表1 訶子多酚在AB-8大孔樹脂上的吸附和解吸附性能Table 1 Adsorption and desorption performance of Terminalia polyphenols on AB-8 macroporous resin

以篩選出的AB-8大孔樹脂進行動態柱實驗，以研究不同因素對訶子多酚的動態吸附解吸附性能，結果見表1。AB-8樹脂的吸附率隨流速的增加而降低，當上柱流速為1.0BV/h 時，AB-8 樹脂的吸附率為 84.04%；當流速提高到5.0BV/h時，其動態吸附率降至74.28%。這是因為隨著上柱流速增大，料液中多酚類化合物還來不及被樹脂充分吸附便流出樹脂柱，雖然較低的流速對吸附有利，但流速過低，操作時間長，在實際生產中應綜合考慮吸附量與效率選擇上柱速率，因此，以3.0BV/h 左右的流速進行上柱為宜。當pH值從4.0增加至6.0時，訶子多酚的吸附率隨pH值增加而增加，當pH值為 6.0時，AB-8樹脂吸附率最高，但pH值超過6.0時，吸附率反而下降，因此，上柱料液的pH值應保持在6.0。訶子多酚質量濃度較低時，隨著訶子多酚質量濃度的提高，AB-8樹脂對訶子多酚的吸附量增加，多酚質量濃度達2.0mg/mL時吸附率最大，但當訶子多酚質量濃度提高到3.0mg/mL時，吸附率下降，這說明吸附趨于飽和。因此選擇上柱料液多酚質量濃度在2.0mg/mL。

選擇乙醇溶液洗脫吸附的訶子多酚，解吸率隨著乙醇體積分數的增加而增加，當乙醇體積分數為20%時，解吸率45.93%；當乙醇體積分數提高到80%時，解吸率達92.20%，再增加乙醇體積分數，解吸率反而略有降低，因此選用80%的乙醇作為洗脫劑。解吸率隨解吸速率增加而下降，當解吸速率為2.0BV/h時，解吸率為91.72%，能滿足要求，考慮到解吸率因素和生產效率，實驗最后確定解吸速率為2.0BV/h。洗脫劑用量增加，解吸率隨之增加，但過大的洗脫劑用量不利于成本控制，選擇洗脫劑用量為3.0BV。

2.2 訶子多酚的提取純化

根據1.3.1節超聲提取訶子多酚，并在2.1節確定的柱參數條件下進行訶子多酚純化，結果見表2。

表2 訶子多酚提取純化結果(n=3)Table 2 Results of purification of Terminalia polyphenols (n=3)

由表2可知，訶子原料中訶子多酚含量高達13.9%，表明訶子富含植物多酚，超聲粗提取物中訶子多酚含量為37.4%，粗提取物的提取率為11.1%，而粗提取物經AB-8大孔樹脂純化后的精多酚，訶子多酚含量為78.4%，訶子精多酚提取率為9.4%。這說明采用AB-8大孔樹脂純化訶子多酚可行性較好。

2.3 訶子多酚油脂抗氧化作用

圖2 添加0.04%訶子多酚對豬油和菜籽油的抗氧化作用Fig.2 Antioxidant effect of Terminalia polyphenols on lard oil and rapeseed oil

由圖2可知，在初始階段，各試樣的POV值基本接近，隨著時間的推移，未加抗氧化劑空白樣POV值隨時間增加明顯且高于添加訶子多酚和茶多酚的試樣，對于新鮮豬油，不加抗氧化劑的空白樣品第9天開始氧化速率迅速增加，而加入訶子粗多酚和訶子精多酚后，訶子粗多酚在前15d POV值無明顯變化。訶子精多酚和茶多酚，在前22d過氧化值無明顯變化，說明訶子多酚對動物油脂具有良好的抗氧化效果，訶子精多酚抗氧化作用明顯強于訶子粗多酚，與茶多酚相近。對于菜籽油，空白樣品在第4天 POV值開始增加，7d后POV值增加已非常明顯，而添加訶子粗多酚、訶子精多酚和茶多酚的樣品分別在第6、9、12天POV值開始增加，訶子精多酚對菜籽油抗氧化作用強于訶子粗多酚，但弱于茶多酚。

因此，純化后的訶子精多酚POV值較訶子粗多酚油脂抗氧化作用明顯增加，表明AB-8大孔樹脂純化的訶子多酚具有良好的油脂抗氧化作用，應用AB-8大孔樹脂純化訶子多酚是可行。

2.4 訶子多酚油脂抗氧化協同增效作用

考慮到訶子精多酚對菜籽油抗氧化作用相對較弱，在訶子精多酚中加入螯合劑檸檬酸以形成復配抗氧化劑，檸檬酸可將金屬離子螯合以抑制Fenton反應，消除羥自由基的產生，通過協同增效作用進一步提高訶子精多酚油脂的抗氧化能力，同時可以降低成本。

圖3 訶子精多酚與檸檬酸復配物對豬油和菜籽油的抗氧化作用Fig.3 Antioxidant effect of Terminalia polyphenols combined with citric acid on lard oil and rapeseed oil

由圖3可知，訶子精多酚與檸檬酸復配后抗氧化能力得到提高。相對于豬油而言，訶子精多酚與檸檬酸復配物對菜籽油的抗氧化作用更加明顯，菜籽油加入訶子精多酚后，第9天開始進入誘導期，但加入檸檬酸后，菜籽油近15d以后才開始進入誘導期，訶子精多酚與檸檬酸復配物的協同抗氧化作用非常顯著。訶子精多酚與檸檬酸復配物對豬油的過氧化也有更好的抑制作用，訶子精多酚第18天開始進入誘導期，加入檸檬酸后，豬油24d以后才開始進入誘導期。因此，在訶子多酚與螯合劑檸檬酸復配后可明顯提高油脂的抗氧化能力。

圖4 訶子精多酚和檸檬酸組成變化對復配物抗氧化作用的影響Fig.4 Antioxidant effect of various Terminalia polyphenols and citric acid mixtures on lard oil and rapeseed oil

圖4分別是固定復配物總加入量為0.04%，改變訶子精多酚和檸檬酸組成對豬油和菜籽油POV值的影響。對于菜籽油而言，訶子精多酚和檸檬酸組成對POV值具有較大的影響，當檸檬酸添加量低于0.008%時，檸檬酸添加量增加有利于復配物抗氧化作用，檸檬酸添加量為0.008%時復配物抗氧化作用最強，但當檸檬酸添加量高于0.008%時，復配物抗氧化作用會逐漸下降。訶子精多酚和檸檬酸組成對豬油POV值影響較菜籽油小，檸檬酸添加量在0.004%～0.012%之間，復配物均具有較強的抗氧化作用。綜合訶子精多酚和檸檬酸組成對豬油和菜籽油POV值的影響，選擇訶子精多酚和檸檬酸復配比為4∶1。

2.5 訶子多酚及復配物抗脂質過氧化作用

圖5 不同質量濃度的訶子精多酚及復配物的抗脂質過氧化活性Fig.5 Lipid peroxidation inhibitory activity of Terminalia polyphenols, citric acid and their mixtures

由圖5可知，低質量濃度時，茶多酚抑制作用強于訶子精多酚，表明茶多酚具有較低的抗氧化起始質量濃度，但高質量濃度時，訶子精多酚抑制率作用強于茶多酚，訶子精多酚最大抑制率高于茶多酚，說明訶子精多酚具有比茶多酚更高的抗氧化容量。訶子精多酚和檸檬酸組成復配物后，低質量濃度條件下抗氧化作用得到改善，抗氧化起始質量濃度低于茶多酚，說明檸檬酸的加入較好地改善了低質量濃度時訶子精多酚抗脂質過氧化作用，并對高質量濃度抗氧化作用亦具有提升作用。

油脂在精煉和脫臭過程中會帶入微量的金屬離子，尤其是鐵離子，研究表明金屬離子能誘導Fenton反應產生羥自由基，誘導脂質過氧化反應，催化油脂的氧化酸敗，訶子精多酚有豐富的酚羥基基團，酚類是極好的氫或電子供體，由于形成的酚類游離基中間體的共振非定域作用和無適合分子氧進攻的位置，因而比較穩定，不會引發新的游離基或者由于鏈反應而被迅速氧化，所以是很好的抗氧化劑[4,9]。而檸檬酸對鐵等金屬離子具有良好的配合作用[4]，可抑制金屬離子誘導自由基的發生，從而降低對油脂的氧化作用，訶子精多酚的抗氧化起始質量濃度高于茶多酚，說明訶子精多酚對鐵等金屬離子的配合作用相對較弱，與檸檬酸復配物后，可起到較好的協同增效作用，使訶子精多酚低質量濃度條件下抗氧化作用得到改善。

3 結 論

民族藥訶子資源豐富，并富含植物多酚，具有多種生物活性，研究表明，通過AB-8大孔樹脂純化，可獲得訶子精多酚，訶子多酚對對植物油和動物油均具有良好的抗氧化作用，能有效抑制油脂過氧化，添加檸檬酸可產生明顯的協同增效作用，且訶子原料成本低于茶多酚，具有較好的開發前景。

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Purification of Polyphenols fromTerminaliaFruits and Their Antioxidant Effect on Lard Oil

GAO Yun-tao，LI Xiao-fen，DAI Jian-hui，BEI Yu-xiang
(Key Laboratory of Ethnic Medicine Resource Chemistry, State Ethnic Affairs Commission and Ministry of Education,School of Chemistry and Bio-technology, Yunnan University of Nationalities, Kunming 650500, China)

Polyphenols fromTerminaliafruits were purified by macroporous resin adsorption. AB-8 macroporous resin showed the best adsorption and desorption capacity among 7 resins tested. The best results for the purification of polyphenols fromTerminaliafruits with AB-8 macroporous resin were achieved by adsorption at a sample loading flow rate of 3.0 BV/h, pH 6.0 and sample concentrations below 2.0 mg/mL and subsequent desorption with 3.0 BV of 80% ethanol at a flow rate of 2.0 BV/h. Under these conditions, the content of purifiedTerminaliapolyphenols was 78.4%. The antioxidant effects ofTerminaliapolyphenols alone or in combination with citric acid on lard oil were studied. The results showed that a mixture ofTerminaliapolyphenols and citric acid at a ratio of 4∶1 had the best antioxidant effect at the dose of 0.04%. Thus, the combination ofTerminaliapolyphenols and citric acid has excellent lipid peroxidation inhibitory effect.

Terminaliapolyphenols；macroporous resin；purification；oil；citric acid；antioxidant activity

TS202.3

A

1002-6630(2012)03-0058-05

2011-02-24

云南省社會發展科技計劃項目(2007B148M)；

民族藥資源化學國家民委-教育部重點實驗室開放基金項目(MJY07010)

高云濤(1962—)，男，教授，博士，研究方向為食品化學。E-mail：yuntaogao@sohu.com