RP-HPLC法測定消痔靈片中沒食子酸的含量

秦貽強 龔 勛 董曉敏

桂林醫學院附屬醫院，廣西桂林 541001

消痔靈片由五倍子、白蘞、卷柏、地榆、槐花、牛羊膽酸等六味中藥材配伍而成，具有收斂止血、解毒斂瘡的功效，用于內外痔瘡[1]。原制劑的質量標準中含量測定項以膽酸為控制指標，目前已有報道進行了消痔靈片中蘆丁的含量測定研究[2]，然而本研究發現該制劑中的主藥五倍子、地榆含有沒食子酸等鞣質成分，具有抗菌、抗炎、止血的藥理活性。在治療痔瘡的中成藥質量標準研究中，沒食子酸[3-4]常被認定為指標成分來進行含量測定，因此，本文采用RP-HPLC法對消痔靈片中的沒食子酸進行含量測定方法研究，為其質量標準進一步的研究提供實驗依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1100型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；威瑪龍WM2010型通用多媒體色譜工作站；HANGPINGFA2004型電子分析天平（上海精科天平儀器廠）；B2500S-MT型超聲儀（上海必能信超聲有限公司）。

1.2 試藥

消痔靈片（重慶希爾安藥業有限公司，批號：100901）；缺五倍子、地榆的陰性對照樣品為自制。沒食子酸對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110831-200302）；甲醇為色譜純，磷酸及其他試劑均為分析純，水為重蒸餾水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性實驗

色譜柱：Sino Chrom ODS-APC18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水-磷酸（6∶94∶0.2）；檢測波長：266 nm，流速：1.0 mL/min；柱溫：（25±1）℃；進樣量：20 μL。 理論板數按沒食子酸峰計算，不低于3 000。見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.2 供試品溶液的制備

取本品10片，研細，精密稱取0.1 g，置100 mL量瓶中，加6%甲醇90 mL，超聲30 min，放冷，加6%甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，取續濾液，即得。

2.3 陰性對照溶液的制備

按消痔靈片的處方制備不含五倍子、地榆藥材的陰性樣品，按“2.2”項下方法操作，制成陰性對照溶液，備用。

2.4 測定波長的選擇

以6%甲醇為溶劑對沒食子酸標準品及消痔靈片樣品溶液進行紫外波長掃描，沒食子酸在266 nm處有最大吸收，消痔靈片在263 nm處有最大吸收；并將二者進注高效液相色譜儀中測定，測定波長為266 nm時，峰形均較好，故選定檢測波長為266 nm。

2.5 線性關系考察

精密稱取沒食子酸對照品約6 mg，置50 mL量瓶中，加6%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得120 μg/mL對照品溶液，備用。分別精密吸取對照品溶液 1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL至10 mL量瓶，加流動相稀釋至刻度，搖勻，按上述色譜條件，進行測定。以對照品進樣濃度為橫坐標，峰面積積分值為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程為Y=50 070.45X-4 335.895，r=0.999 1。結果表明，對照品在18～48 μg/mL濃度范圍呈良好線性關系。

2.6 方法學考察

2.6.1 精密度實驗 取同一濃度的對照品溶液，連續重復進樣6次，測定沒食子酸峰面積平均值，求得RSD=0.39%。表明儀器精密度良好。

2.6.2 穩定性實驗 取同一供試品溶液，于 0、2、4、6、8、10、12 h各進樣一次，測定峰面積積分值。求得RSD=0.55%。表明供試品溶液中沒食子酸在12 h內穩定性良好。

2.6.3 重復性實驗 精密稱取同一批樣品6份，按上述供試品溶液制備方法和色譜條件測定沒食子酸峰面積積分值，求得RSD=2.19%。表明該方法重復性良好。

2.6.4 加樣回收率實驗 取已知含量的同一批號供試品約0.05 g，精密稱定6份，分別加入適量的沒食子酸對照品，按供試品制法制備和上述色譜條件下測定，平均回收率=99.75%，RSD=0.97%。見表1。

2.7 樣品含量測定

按上述方法測定批號為100901的消痔靈片樣品，平行條件下提取測定3次，計算得平均值，求得每片消痔靈片（每片質量為0.2 g）含沒食子酸為6.39 mg/片。

3 討論

消痔靈片的組方中，五倍子、地榆與白蘞三種藥材均含有沒食子酸，而沒食子酸具有的抗菌、抗炎、抗病毒等作用與消痔靈片抗菌、抗炎、止血的功效相吻合[5]。消痔靈片的原標準建立了以五倍子、地榆對照藥材及蘆丁對照品的薄層色譜定性鑒別，含量測定項選擇了膽酸為測定指標，未能很好體現該制劑中有效成分沒食子酸的含量控制。因此為更好地控制消痔靈片的質量，本研究在其原質量標準基礎上，采用高效液相色譜法測定了沒食子酸總含量，為綜合評價該制劑的內在質量及開發利用提供科學的實驗依據。

表1 沒食子酸加樣回收率試驗結果（n=6）

本文在實驗中發現，以甲醇溶液制備的沒食子酸對照品的色譜峰峰形不佳，而以含甲醇-磷酸的水溶液制備的沒食子酸對照品溶液和供試品溶液則峰形良好。以甲醇溶液、6%甲醇、30%甲醇、50%甲醇四種溶劑的提取效率，結果表明，甲醇溶劑提取率較低，其他三溶劑的得率無明顯差異，但用6%甲醇提取的溶液雜質較少，顏色較淺，因此選擇6%甲醇為提取溶劑。實驗中曾觀察到柱溫的變化會影響不同圖譜中同一色譜峰的保留時間，為獲得重現性較好的色譜圖及相應的峰面積，必須保持柱溫恒定。

[1]中國藥典委員會.衛生部藥品標準[M].北京：人民衛生出版社，1998：275.

[2]王寶琴.中成藥質量標準與標準物質研究[M].北京：中國醫藥科技出版社，1994：106.

[3]杜敏，顏仁梁.HPLC法測定復方鹽膚木化痔膠囊中沒食子酸的含量[J].中藥新藥與臨床藥理，2011，22（1）：102-104.

[4]毛長智，張赟赟，甘露.HPLC法測定消痔軟膏中沒食子酸的含量[J].中醫藥導報，2010，16（9）：99-100.

[5]陳新玉，李健和，黎銀波，等.地榆、地榆片、地榆炭的質量標準研究[J].中國醫藥導報，2011，8（17）：64-67.