膠體金法檢測在判定耐甲氧西林金黃色葡萄球菌中的價值探討

林 翀 蘇應仙 林明冠 張天蔚

海南省農墾總局醫院檢驗科，海南海口 570311

金黃色葡萄球菌（staphyloccocus aureus）是人類的一種重要病原菌，隸屬于葡萄球菌屬，可引起多種嚴重感染[1]。隨著抗菌藥物的種類不斷增加及臨床廣泛應用，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）在全球范圍內不斷增加，成為院內、外感染的重要病原菌之一。2001年我國的全國調查報告顯示，MRSA在金黃色葡萄球菌中所占的比例波動在40%～90%之間[2-3]。本研究通過比較苯唑西林藥敏紙片擴散法、乳膠凝集法及膠體金法判定MRSA株的情況，旨在探討膠體金法檢測判定MRSA株的價值，現將相關的臨床資料總結并報道如下：

1 資料與方法

1.1 菌株來源

收集2008年3月～2009年2月從我院住院或門診患者的痰液、清潔中段尿、膿液等各種臨床標本中分離出的金黃色葡萄球菌75株，質控菌采用金黃色葡萄球菌ATCC25923，購于衛生部臨床檢驗中心，以2010年CLSI為判斷標準。

1.2 方法

將收集到的75株金黃色葡萄球菌分別采用苯唑西林（1 μg/片）藥敏紙片擴散法、乳膠凝集法及膠體金法檢測。

1.2.1 苯唑西林藥敏紙片擴散法 采用苯唑西林藥敏紙片擴散法檢測75株金黃色葡萄球菌，若苯唑西林藥敏紙片抑制圈的直徑≤10 mm，可判斷為MRSA。苯唑西林藥敏紙片由Oxoid公司提供，在有效期內使用。

1.2.2 乳膠凝集法 首先提取標本中的PBP2a蛋白，然后用包被有抗PBP2a單克隆抗體的乳膠顆粒進行凝集檢測。乳膠試劑反應圈產生凝集時為PBP2a陽性，菌株為MRSA。乳膠凝集試劑由Oxoid公司提供，嚴格按照試劑說明書進行。

1.2.3 膠體金法 提取標本中的PBP2a蛋白，加樣于檢測試紙條，試紙條檢測帶和質控帶均有顯色條帶則為陽性，即判斷為MRSA，僅質控帶顯色條帶的為陰性，如質控帶未出現條帶，則為體系失效[4]。采用北京青元盛康生物醫藥有限公司生產的MRSA膠體金法試劑盒，嚴格按說明書進行操作。

1.3 觀察指標

觀察苯唑西林藥敏紙片擴散法、乳膠凝集法及膠體金法的檢測MRSA的敏感度及檢測時間并進行比較分析。

1.4 統計學方法

采用SPSS 13.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（±s）表示，三組間比較采用方差分析，組間兩兩比較，采用LSD-t檢驗；計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三種方法檢測MRSA敏感度及符合率情況

苯唑西林藥敏紙片擴散法和膠體金法的檢測敏感度均高于乳膠凝集法，但經χ2檢驗，差異無統計學意義（P＞0.05）；膠體金法與苯唑西林藥敏紙片擴散法檢測MRSA的符合率高達100.0%。見表1。

表1 三種方法檢測MRSA的敏感度比較（株）

2.2 三種方法檢測時間比較

苯唑西林藥敏紙片擴散法的檢測時間為（1080.6±36.3）min，乳膠凝集法的檢測時間為（38.2±1.7）min，膠體金法的檢測時間最短，僅為（9.2±0.4）min，膠體金法與苯唑西林藥敏紙片擴散法及乳膠凝集法比較，差異有統計學意義（P＜0.01）。

3 討論

目前臨床上由于MRSA的出現致使感染趨勢不斷上升，多重耐藥性增加，現有的抗生素很難控制這些耐藥菌株的感染，正確快速的檢測MRSA并找出有效控制其感染的藥物，是目前臨床微生物工作的任務之一。本研究通過比較苯唑西林藥敏紙片擴散法、乳膠凝集法及膠體金法判定MRSA株的情況，探討膠體金法檢測在判定MRSA株中的價值。

根據苯唑西林藥敏紙片抑制圈≤10 mm來判斷MRSA是一種簡便的方法，但耗時長，而且容易受到如培養基、細菌接種量、藥物濃度及培養時間的等諸多因素的影響。做好培養基的室內質控是準確判斷MRSA的重要手段，但花費的時間更長，不利于為臨床MRSA檢測提供準確而快速的診斷。

乳膠凝集法快速、簡便，且無需特殊儀器和技術，對臨床早期檢出MRSA很有幫助，但檢測成本高，且因為PBP2a的低表達可能會產生假陰性[3]。

膠體金是一種常用的標記技術，是以膠體金作為示蹤標志物應用于抗原抗體的一種新型的免疫標記技術，有其獨特的優點[5]，近年已在各種生物學研究中廣泛使用，在臨床使用的免疫印跡技術中幾乎都使用其標記。同時，在流式、電鏡、免疫、分子生物學以至生物芯片中均可能用到。膠體金是金的水溶膠，膠體金法是指以膠體金為顯色標記物的檢法方法[6]。1971年Faulk和Taytor將膠體金引入免疫化學，此后免疫膠體金技術作為一種新的免疫學方法，在生物醫學各領域得到了日益廣泛的應用。膠體金是由氯金酸（HAuCl4）在還原劑如白磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉、鞣酸等作用下，聚合成的一定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩定的膠體狀態，形成帶負電的疏水膠溶液，由于靜電作用而成為穩定的膠體狀態，故稱膠體金。膠體金在弱堿環境下帶負電荷，可與蛋白質分子的正電荷基團形成牢固的結合，由于這種結合是靜電結合，所以不影響蛋白質的生物特性。除了與蛋白質結合以外，膠體金還可以與許多其他生物大分子結合，如SPA、PHA、ConA等。根據膠體金的一些物理性狀，如高電子密度、顆粒大小、形狀及顏色反應，加上結合物的免疫和生物學特性，使膠體金廣泛地應用于免疫學、組織學、病理學和細胞生物學等領域。膠體金標記實質上是蛋白質等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過程。杜玉萍等[7]以金黃色葡萄球菌菌體抗原免疫家兔獲得多克隆抗血清，利用膠體金免疫層析技術，采用二步法檢測金黃色葡萄球菌，建立的膠體金免疫層析試紙法能在60 min內完成檢測，靈敏度實驗結果顯示其檢測靈敏性為1×106cfu/mL；特異性實驗檢測顯示其與副溶血弧菌、鼠傷寒沙門氏菌、痢疾桿菌、霍亂弧菌小川型、O139型及569B型等菌無交叉反應，但與耶爾森氏菌、大腸桿菌標準株（ATCC25922）、銅綠假單胞菌標準株（ATCC27853）有一定交叉。有學者用膠體金標記產腸毒素金黃色葡萄球菌多價抗體，先制成膠體金探針，進而制成檢測產腸毒素金黃色葡萄球菌免疫層析法（GICA）檢測試紙條，用該法檢測產腸毒素葡萄球菌，具有簡便、快速、特異性好、無需儀器及細菌抗原無需進行特殊處理等優點，預示著本方法具有廣闊的應用前景[8-10]。

本組實驗結果顯示，膠體金法和苯唑西林藥敏紙片擴散法的符合率達100%，兩者敏感性均高于乳膠凝集法，但差異無統計學意義（χ2=0.260，P＞0.05），且膠體金法的檢測時間最短，僅為（9.2±0.4）min。

綜上所述，膠體金法是一種快速、準確的判定MRSA菌株的方法，值得進一步研究。

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[2]馬越，金少鴻.我國細菌耐藥性監測研究的新特點[J].中華檢驗醫學雜志，2005，28（4）：344-348.

[3]張國祥.112例耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的臨床特征[J].中外醫學研究，2010,8（23）：77-78.

[4]邵軍軍，常惠蕓.膠體金免疫層析試紙條在病原體檢測及醫學診斷中的應用[J].實用診斷與治療雜志，2008，22（1）：39.

[5]陳映紅.膠體金法檢測HBsAg的方法學評價[J].現代醫藥衛生，2009，25（14）：2196.

[6]宗揚勇，朱愛娟.膠體金法在梅毒實驗診斷中的應用價值[J].現代中西醫結合雜志，2009，18（4）：430.

[7]杜玉萍，陳清，王雅賢，等.膠體金免疫層析法檢測金黃色葡萄球菌的初步研究[J].熱帶醫學雜志，2006，6（6）：650-652.

[8]許保疆，郭成留.免疫層析快速診斷試紙條的制備及在動物疫病診斷上的應用[J].中國畜牧獸醫，2009，36（3）：48.

[9]王清，吳振廷，王學林，等.免疫膠體金標記技術及其在植物保護上的應用前景[J].安徽農業科學，2005，33（3）：485.

[10]許欣，王鋒.免疫膠體金技術及其在臨床診斷上的研究進展[J].江西農業學報，2009，21（6）：125.