FVB和EIIa-Cre小鼠胚胎冷凍保存研究

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(浙江大學實驗動物中心，浙江杭州 310058)

人類疾病動物模型是研究疾病病因、揭示疾病發生機理及評價治療措施等的重要實驗對象和材料。由于基因修飾小鼠疾病模型存在著極其重要的理論研究價值和廣泛的實際應用潛力，所以對小鼠模型進行長期保種顯得越來越重要。常規保種方法用于大量基因修飾小鼠維持時，存在許多不足，如維持成本高、疾病威脅、遺傳漂變等，且這些小鼠往往對營養、環境等因素的要求也不一樣[1]。胚胎和精子的冷凍保存及復蘇技術則可彌補常規動物保種和繁育方法的缺陷。

FVB小鼠是一種常用的實驗小鼠品系，起源于遠交系Swiss小鼠。1935年，該小鼠飼養于美國NIH研究所，1966年起開始選育。20世紀70年代初，在HSFS/N系小鼠培育至第八代時，發現部分小鼠攜帶Fv1 b基因，表現對B strain Friend白血病毒敏感，隨后育成Fv1 b同型合子近交系，稱作FVB品系。FVB繁殖力較強，窩產仔數多，受精卵前核大而顯著，易于顯微注射DNA，是適用于轉基因實驗的小鼠品系[2]。EIIa-Cre小鼠是以FVB小鼠為背景制作的轉基因小鼠品系，轉入的基因為純合子，整合于No 6染色體第18 -95 Mbp的DNA區間，是廣泛應用于突變和轉基因研究的工具鼠[3]。

本研究以EIIa-Cre小鼠和其背景鼠FVB為研究對象，進行胚胎冷凍保存方法及其影響因素的研究。采用慢速冷凍和快速冷凍方法，探索其解凍和復蘇程序的最佳條件，并比較兩種方法的優缺點，為建立基因修飾小鼠胚胎保存資源庫奠定基礎。

1 材料與方法

1.1小鼠來源及胚胎獲取

小鼠來源。EIIa-Cre和FVB小鼠均購于南京大學模式生物研究所，飼養于屏障設施內。

受精卵獲取。選取成熟未配雌性小鼠(4～6周齡[4])，腹腔注射PMSG 5～10 IU/只，48 h后腹腔注射HCG 5～10 IU/只，隨即與同基因型的成年雄性小鼠合籠。然后于注射HCG 14～16 h后處死雌鼠，連同子宮一起取出輸卵管，用解剖針刺破輸卵管膨大部，引出卵子團至HTF培養基中，置培養皿于37℃、5%CO2孵箱中培養。

2-細胞期胚胎獲取。同上述超排交配(以陰栓為準)24 h后處死雌鼠，連同子宮一起取出輸卵管(然后剪下輸卵管)，用注射器進行灌流沖洗，沖出胚胎，再將含有胚胎的培養基滴入培養皿中。

1.2玻璃化液配制

DAP213的配制。先用4M的DMSO和6M的PG(propylene glycol)溶解在PB1溶液中，形成A液；然后將2M的AA(acetamide)溶解在PB1中，形成B液。

最后A液和B液等量混合在一起，即形成DAP213抗冷凍劑[5]。

1.3胚胎冷凍

室溫下配置1M的DMSO溶液，按冷凍麥管數量在直徑3 cm的培養皿中制成數個液滴，每個液滴約100 μL。

將待冷凍的胚胎移入DMSO中，每個液滴約移入40個胚胎，然后依次將其他麥管中的胚胎移入液滴中，讓其自然沉降至液滴底部。將5 μL的1M DMSO溶液與胚胎一起移至冷凍管中，放入0℃的冷卻裝置內。

5 min后，將預先冷卻的胚胎保存液(DAP213)45 μL移入裝有胚胎的冷凍管內。再經5 min后，將冷凍管放入固定裝置，直接放入液氮中。

1.4冷凍胚胎的融解

將解凍液(0.25M蔗糖溶液)放入37℃、5%CO2培養箱中平衡30 min。

從液氮罐中取出冷凍管，倒掉管內液氮，室溫下放置約30 s。將預熱的解凍液注入冷凍管中，并用移液器迅速吹吸約10次，然后將內容物移至培養皿中，回收胚胎。

用嘴吸式移液器將回收的胚胎移入KSOM培養液滴中，靜止10 min，沖洗胚胎2次后，在解剖鏡下進行形態學檢查。

1.52-細胞期胚胎的移植

選擇10周齡左右母鼠制作備用的假孕受體母鼠。

先將母鼠放入輸精管結扎的雄性小鼠合籠，進行交配。次日，將確認有陰道栓的雌鼠作為胚胎移植受體小鼠，麻醉后在其腰椎處剃毛，沿正中位置開一小口，再在腹部兩側肌肉分別開0.5 cm的小口，從腹腔內引出卵巢、輸卵管和子宮。

確認輸卵管喇叭口和膨大部位，在喇叭口之間的輸卵管壁上剪開一切口，將移植針插入到輸卵管中，植入胚胎，縫合后將小鼠放在37℃環境下保溫，直到蘇醒。

1.6統計方法

采用SAS 軟件對數據進行單因素三水平方差分析。

分析比較兩品系小鼠的受精卵和2-細胞胚胎期卵細胞的超排效率，胚胎復蘇率、妊娠率和產仔率。

2 結果與分析

2.1超排卵數 詳見表1。

表1 FVB和EIIa-Cre小鼠超排卵數測定結果

由表1可知，FVB和EIIa-Cre小鼠超排后獲取的受精卵數量分別為33.71枚和24.23枚，發育至2-細胞期的數量分別為30.43枚和17.08枚，EIIa-Cre的胚胎數明顯少于FVB。超排后直接獲取2-細胞期胚胎平均數分別為28.17枚和19.70枚，EIIa-Cre的胚胎數也明顯少于FVB。

2.2胚胎復蘇移植結果 詳見表2。

表2 FVB和EIIa-Cre的復蘇移植結果

由表2可知，FVB和EIIa-Cre小鼠的胚胎復蘇率、妊娠率和產仔率均存在較大差異，分別為77.7%和63.0%、80.0%和57.1%、13.6%和8.2%，FVB小鼠明顯高于EIIa-Cre小鼠。

3 討論

3.1小鼠超排卵效果受多種因素影響，其中主要因素有小鼠周齡、激素注射劑量、PMSG和HCG注射間隔時間及健康狀態等。

關于激素注射劑量、PMSG和HCG注射間隔時間的研究，相關報道較多[6-7]。董婉維等[4]報道4～6周齡FVB超排效果最佳，這可能與雌鼠性成熟程度有關，4～6周齡小鼠已達到性成熟，卵泡成熟周期已經開始，對卵泡刺激素(FSH)有反應的卵泡數達峰值，排卵數明顯高于6～10周齡的FVB小鼠。

EIIa-Cre為FVB背景小鼠，采用相同方案，取得了較好的超排效果，表明兩者的最佳超排條件可能相近。

本研究顯示，EIIa-Cre的胚胎數(受精卵或2-細胞期)明顯少于FVB小鼠，這可能與其遺傳背景改變有關，Spearow J L等[8]和Byers SL等[9]曾報道小鼠品系的遺傳背景是影響超排效果的主要因素之一。

3.2胚胎凍存復蘇技術是一種簡單、實用、經濟而可靠的保種方法，可降低動物飼養和繁育成本，擴大動物品系的保存能力，也可隨時為其它胚胎工程技術，如胚胎移植、胚胎分割、體外受精、動物性別控制、轉基因動物技術和胚胎干細胞技術等提供可用胚胎。

通過建立胚胎庫，可在世界范圍內運送胚胎，從而取代活體運輸，既降低了費用又可避免疾病傳播，還能解決遺傳漂變及人為、環境因素造成的動物生物學特征和遺傳特性的改變等問題。

隨著基因修飾動物品系的急劇增加，對胚胎冷凍技術提出了更高的要求，不同品系最佳凍存復蘇條件存在差異，人們又很難逐個品系摸索其最佳凍存復蘇條件。本研究通過開展基因修飾品系與其背景品系的凍存復蘇對比研究，嘗試建立背景品系最佳凍存復蘇條件用于各個基因修飾品系胚胎保存的可能性。

結果顯示，相同方法 EIIa-Cre的各項效率均低于其背景品系FVB，但其各項數據均不影響該品系成功保種，筆者采用適當增加EIIa-Cre超排個體可明顯提高保種效率。所建立的方法，可為今后其他基因修飾動物品系的胚胎保存提供參考。

[1]Rall W F, Fahy G M. Ice-free cryopreservation of mouse embryo sat-196℃ by vitrification[J]. Nature, 1985, 313:573-575.

[2]Cathy E, Bakker, Coleta, Verheij, et a1. Fmrl knoc koutmice:Amodel tostudy fragile Xmentalre tardation[J].Cell,1994,78:23.

[3]Yunzheng Le, Brian Sauer. Conditional gene knockout using cre recombinase[J]. Molecular Biotechnology,2001,17(3):269-275.

[4]董婉維, 周生來, 楊 葳,等. FVB小鼠超排卵及胚胎冷凍技術的研究[J]. 中國比較醫學雜志,2006,16(11):652-654.

[5]徐平. 實驗動物管理與使用操作技術規程[M]. 上海科學出版社,2007,96-104.

[6]高建明, 候文元, 焦古海. 小鼠超排卵效果分析[J]. 北京農學院學報, 2000, 15(1):25-28.

[7]戴麗軍, 黃月玲, 葉炳飛. C57BL/6J小鼠超排卵的研究[J]. 中國實驗動物學報, 2003,1l(1):5l-53.

[8]Spearow J L，Barkley M. Genetic control of hormone-induced ovulation rate in mice[J]. Biol Reprod,1999,61:851-856.

[9]Byers S L，Payson S J，Taft R A. Performance of ten inbred mouse strains following assisted reproductive technologies(ARTs)[J]. Theriogenology,2006;65(9):1716-1726.