犬細小病毒自家滅活疫苗的血凝抑制抗體測定

(公安部沈陽警犬技術學校，遼寧沈陽 110034)

犬細小病毒病是由犬細小病毒感染引起的一種急性傳染病 ,以劇烈嘔吐、出血性腸炎和白細胞顯著減少為主要特征 ,并可引起犬急性心肌炎,癥狀與貓泛白細胞減少癥相似 ,是危害我國養犬業最為嚴重的傳染病之一。

目前，該病的預防，國內仍傾向于使用CPV滅活苗和弱毒苗。在遼寧地區發生細小病毒病的仔犬病料經過電鏡及PCR檢測，發現疑似細小病毒變異株，確定變異的基因片段還需進一步做病毒分離及細胞培養實驗。目前市售疫苗中無一種能對細小病毒病起較強的保護作用。所以，一種特殊的免疫措施—自家滅活疫苗，不失為犬場傳染病流行、緊急狀態下的緊急控制措施。

自家滅活疫苗就是取發病犬群中的犬組織，加工做成滅活疫苗。本研究通過對部分仔犬群進行自家滅活疫苗免疫，測定免疫后的細小病毒抗體水平，并通過實際的免疫效果檢驗免疫程序，以指導犬細小病毒病的控制工作。

1 試驗方法

隨機選擇試驗犬30頭，分別在仔犬免疫前、首免后15 d、二免后15 d抽取仔犬血樣，應用CPV HA-HI試驗診斷技術對抗體水平進行檢測，進行免疫效果分析。

2 試驗過程

第一步 選擇健康狀況良好、體重相仿的30頭仔犬作為試驗犬。隨機選擇15頭為試驗組，注射自家滅活疫苗；另15頭為對照組，注射市售疫苗。

第二步 當仔犬達30日齡時，當日清晨前肢靜脈采血2 ml。

第三步 新鮮血液3000 r/min，離心10 min，析出血清。先用PBS液稀釋5倍，并于56℃水浴滅活30 min，待涼。

第四步 配備5 mL/L(0.5%)豬紅細胞懸液。

第五步 次日，將稀釋后的備用血清加入1/10待檢血清體積的試驗用豬紅細胞，搖勻后室溫吸收(至少)2 h，3000 r/min，離心10 min，取上清液待檢。

第六步 采用微量法在96孔型板上進行，用25 μL移液管向第一排的1～9、11、12孔內各吸取25 μL混合液移至第2孔，充分吸吹混合，再吸取25 μL混合液移至第3孔，如此循環到第9孔，最后吸取第9孔的混合液25 μL棄去。第10、11孔不加待檢血清。第12孔滴加25 μL待檢血清。再向1～9孔和11孔中滴加25 μL血凝抗原(含4個HA單位)，10、12孔不加，37℃作用30 min后向1～12孔各滴加50 μL 0.5%豬紅細胞懸液。所有試驗均在2～4℃下進行，直至紅細胞對照清亮，一般4 h后觀察結果。每一組包括紅細胞對照、血凝抗原對照和待檢血清對照。

第七步 分別在仔犬首免后15 d、二免后15 d重復以上操作過程。

3 試驗結果

詳見表1。本試驗是對CPV抗體效價的定性測定，一般1∶80是抵抗CPV的保護效價。

表1 仔犬CPV抗體效價

由表1可見，免疫前，試驗組與對照組抗體效價均為1∶80以上，無明顯差異。此后，試驗組經過二次免疫后效價明顯增高，而對照組顯然疫苗未起作用。

根據試驗，應用ELISA方法檢測分析CPV血清效價，結果表明使用自家滅活苗免疫，短期內就能起到對犬細小病毒的保護作用。

4 討 論

4.1根據細小病毒出現的變異株及目前國內外市售疫苗不能有效保護細小病毒病之故，使用自家滅活疫苗救急，效果理想。據試驗，自家滅活疫苗主要具有以下優點。

一是具有多種抗原成分。由于用于制備自家組織滅活苗的病料采自發病犬群，其中抗原成分基本包括了本群存在的病原，比較符合免疫保護與疾病控制要求，較全面的抗原有可能在一定程度上誘導全方位的保護力，這是—般單苗難以達到的。

二是犬體組織細胞成分的特殊作用。這只是一種假設。自家組織疫苗中的主要成分是犬體組織細胞，各種病原抗原的含量相比之下是次要的。解剖用過自家組織滅活苗免疫的犬只常能發現，全身淋巴系統增生，淋巴結腫大明顯。

三是免疫篩選作用。實施該免疫措施后，由于大量抗原的引入，犬只機體處于持續較強免疫應激狀態，抵抗其它病原或環境變化的能力降低，于是優勝劣汰，加速部分體況差犬、帶毒犬、亞健康犬表現癥狀，從而可盡早識別淘汰，使疾病得到緩解。

4.2多數仔犬在6～8周齡(最長14周齡)時，母源抗體迅速減少或消失,一般1∶80是抵抗CPV的保護效價。一般幼犬3周齡內很少感染CPV,3周齡后、幼犬母源抗體<1∶80，對CPV最易感。

4.3因CPV對外界理化因素抵抗力較強，糞便中的CPV可存活數月至百年；并且細小病毒病具有高度傳染性；40日齡仔犬易感性最強、病死率較高。所以選取仔犬作為研究對象。整個試驗過程采用血凝抑制試驗，其實驗原理及實驗路線非常成型。根據細小病毒具有較強的血凝活性，在4℃和25℃均能凝集豬紅細胞這一特性。但血凝可受很多外在條件的影響(溫度影響)，因此在具體實驗中，必須探索出血凝可獲得高滴度結果的溫度條件。