結直腸癌患者外周血CD4+CD25high調節性T細胞的作用

張勤英，朱 凡，王毓明

(南京醫科大學附屬蘇州醫院、蘇州市立醫院北區腫瘤內科，江蘇蘇州215008)

近年來，有較強免疫抑制功能的CD4+T細胞亞群受到廣泛關注。調節性T細胞 (regulatory T cell，Treg)作為一群具有免疫抑制效應的T細胞亞群，在維持機體自身耐受和抑制自身免疫疾病發生發展中具有重要作用，其中CD4+CD25highTreg等與腫瘤免疫逃逸有密切關系。本研究應用流式細胞儀測定了36例結直腸癌患者及30名健康對照者外周血中CD4+CD25highTreg及其表面功能性標志分子細胞毒T淋巴細胞相關抗原 －4(cytotoxic T lymphocyte antigen-4，CTLA-4)和叉狀頭/翅膀狀螺旋轉錄因子(transcription factor forkhead box P3 protein，FoxP3)，現將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選擇2010年1月至2011年6月在我科住院接受治療的結直腸癌患者36例，男性20例，女性16例;年齡46～73歲，平均年齡(56.6±10.2)歲。所有患者均經手術及術后病理確診，近1個月未接受抗腫瘤治療，近2個月未使用過免疫調節劑，無近期感染病史和自身免疫性疾病史。健康對照組為我院體檢中心提供的年齡、性別具有可比性的30例體檢健康者，男性17例，女性13例;年齡36～68歲，平均年齡(52.2 ±12.3)歲。

1.2 主要試劑 藻紅蛋白(PE)結合的CD4-PE單抗和異硫氰酸熒光素(FITC)標記的CD25-FITC單抗購自美國BD公司;葉綠素蛋白復合物(PerCP)結合的CTLA-4 PerCP、藻青蛋白標記(APC)FoxP3單抗及配套染色試劑均購自美國eBioscience公司;陰性對照采用的IgG2a-FITC、IgG1-PE和IgG-PerCP購自美國BD公司。

1.3 檢測方法 采集3 mL肘靜脈血，EDTA抗凝，以淋巴細胞分離液獲得單個核細胞，計數，調整細胞懸液濃度為 1 × 107mL－1，取樣 100 μL，分別加入 10 μL CD25、10 μL CD4、5 μL CTLA-4 和 10 μL FoxP3 抗體，室溫下避光10 min，加溶血素2 mL后再避光10～15 min，根據紅細胞裂解狀態，以1 500 r·min－1離心5 min，棄上清液，加PBS液洗滌1次，再加200～500 μL PBS液混勻，上流式細胞儀檢測。對照管按同樣測定條件上機檢測。結果分析用FACSDIVA軟件。在前向角散射光－側向角散射光(FSC-SSC)散點圖上選定淋巴細胞群，以CD4+和SSC設門，選擇CD4+T細胞分析門內相關Treg細胞亞群。

1.4 統計學處理 采用SPSS 17.0進行統計分析，實驗數據以±s表示，組間比較采用t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

流式細胞儀分別檢測CD4+T細胞、CD4+CD25highTreg、CD4+CD25highFoxP3 Treg 和 CD4+CTLA-4 Treg。R1為淋巴細胞散點圖(圖1)，CD4+T細胞以R1設門，CD4+CD25highTreg以 CD4+設門，CD4+CD25highFoxP3 Treg和CD4+CTLA-4 Treg均以CD4+CD25high設門(圖2)。與健康對照組比較，結直腸癌組患者外周血CD4+CD25+FoxP3 Treg顯著增多(P ＜0.01)，CD4+CD25highTreg和 CD4+CTLA-4 Treg增多(P ＜0.05)，CD4+T細胞減少(P＜0.05)。見表1。

表1 各組外周血不同T細胞水平的測定結果

3 討論

在生理狀態下，機體免疫系統具有免疫監視作用，能有效防止腫瘤的發生。在腫瘤患者中免疫系統對腫瘤抗原的反應明顯下降，不能有效限制、清除腫瘤細胞，這與腫瘤的形成有密切關系。目前認為這種對腫瘤抗原弱免疫應答的原因可能是腫瘤抗原為變異的自身抗原或機體免疫功能下調，即免疫穩態破壞。

Treg作為具有免疫抑制效應的T細胞亞群，能特異性抑制T細胞對外源性和自體抗原的免疫反應，因此在維持對自身成分免疫耐受的同時，也可能阻止機體對自體同源腫瘤細胞的免疫。CD4+CD25+Treg為具有獨立功能的T細胞亞群，在免疫抑制機制和維持自身免疫耐受過程中具有十分重要的作用，在一些腫瘤的研究中，已證明了CD4+CD25+Treg可以抑制體內抗腫瘤反應［1］。

CD4+CD25+Treg占CD4+T細胞的5% ～10%，具有免疫調節活性的細胞主要是高表達CD25+的細胞，即CD4+CD25highTreg。結直腸癌患者Treg介導的免疫耐受和腫瘤的生長密切相關，Treg可能直接參與腫瘤的發生過程，也可以提示惡性腫瘤的預后。本研究結果顯示，36例結直腸癌患者外周血CD4+CD25highTreg增加，提示結直腸癌患者免疫功能失調與其外周血Treg比例增加有關，在結直腸癌發展過程中CD4+CD25highTreg可能起著重要的作用。

腫瘤局部Treg數量升高的原因主要為:1)腫瘤抗原和趨化因子作用使得天然CD4+CD25highTreg在腫瘤局部募集和擴增，LAGE1和ARTC1等腫瘤抗原刺激其活化增殖，導致腫瘤部位腫瘤抗原特異性CD4+CD25highTreg比例增加;2)TCR刺激和TGF-β聯合作用誘導FoxP3在CD4+CD25highT細胞中的表達，導致其轉變成具有調節活性的CD4+CD25highTreg［2］。

CTLA-4是一種抑制性調節分子，其編碼基因位于人類2號染色體q33區，表達受到嚴密調控。除靜止T細胞外，已活化的T細胞、Treg的一些亞群和Th細胞中均存在CTLA-4。CTIA-4與CD28競爭性結合配體，在T細胞的活化反應中發揮著負性調節作用。CTLA-4和B7的結合導致細胞活化和增殖信號的下調，IL-2的合成也被抑制。CTLA-4能與 CD80和CD86結合，向T細胞發出抑制信號，使活化T細胞的子代細胞對抗原刺激的敏感性降低，從而發揮負性調節作用。

最近有研究發現，一類具有免疫抑制效應的FoxP3+Treg在腫瘤局部募集、擴增，通過細胞與細胞間接觸的方式和分泌調節性細胞因子IL-10、TGF-β等的方式抑制CD4+和CD8+T細胞的分化和增殖，從而抑制 T細胞抗腫瘤免疫效應，促進腫瘤生長［3］。FoxP3并非細胞活化的標記，而是Treg內的標記分子，該蛋白的表達對CD4+CD25+Treg的發育成熟、功能發揮等方面均具有重要作用，也是目前CD4+CD25+Treg最敏感的標記，其作為特異性表達于 CD4+CD25+Treg表面的一種轉錄因子，有別于CD25、CTLA-4等，逐漸成為目前公認的CD4+CD25+Treg特異性的標記［4－5］。FoxP3 不但限制了特異性表達的CD4+CD25highTreg，而且對這些細胞調節功能的誘導起關鍵作用。將FoxP3基因導入CD4+CD25+Treg，這些細胞受刺激時就表現出與自然產生的CD4+CD25+Treg的無能或抑制表型，也能在體外抑制T細胞的免疫應答。因此，FoxP3在CD4+CD25+Treg的發育和功能發揮上是必需的。通過檢測CD4+CD25highTreg百分數及其功能性標志分子FoxP3和CTLA-4可以較全面地反映CD4+CD25highTreg的數量和功能狀況。

近年來，結直腸癌免疫治療有了很大的發展，主要方法除了傳統的非特異性主動免疫治療外，還有特異性主動免疫治療、免疫基因治療、被動性免疫反應、靶向治療等［6］。如表皮生長因子受體(epithelial growth factor receptor，EGFR)的表達在結直腸癌組織中明顯高于正常結直腸黏膜及良性病變組織;隨不典型增生的加重，EGFR表達增加。如果對于EGFR依賴性或部分依賴性的結直腸癌患者選擇以EGFR為靶點的抗腫瘤治療，患者的生存質量會大大提高［7］。本研究發現，結直腸癌患者外周血中CD4+CD25highFoxP3 Treg增高，這表明CD4+CD25highFoxP3 Treg的變化較CD4+CD25highTreg及 CD4+CTLA-4 Treg更為敏感。檢測CD4+CD25highFoxP3 Treg可進一步了解結直腸癌患者體內免疫狀態和疾病活動性，這些發現為腫瘤的靶向免疫治療提供了依據。免疫調節藥物的出現代表了腸道惡性腫瘤及其他惡性腫瘤免疫治療的方向。某些藥物，如自體腫瘤細胞疫苗、重組CEA疫苗等已進入臨床研究。然而，本研究病例數較少，不能排除抽樣誤差，尚需擴大樣本量進一步研究。

［1］許浪，王育斌，劉丹，等.CD4+CD25+調節性T細胞及其相關基因FoxP3在非小細胞肺癌患者外周血中的變化［J］.中國醫藥導報，2009，6(7):23－25.

［2］張利寧.調節性T細胞與腫瘤［J］.中國腫瘤生物治療雜志，2007，14(3):201－205.

［3］陶學芳，李和權，周建英，等.FoxP3、CD3在非小細胞肺癌組織中的表達及意義［J］.浙江醫學，2010，32(1):46 －48，51.

［4］Sakaguchi S.Naturally arising FoxP3-expressing CD25+CD4+regulatory T cells in immunological tolerance to self and non-self［J］.Nat Immunol，2005，6(4):345－352.

［5］Williams LM，Rudensky AY.Maintenance of the FoxP3-dependent developmental program in mature regulatory T cells requires continued expression of FoxP3［J］.Nat Immunol，2007，8(3):277 － 284.

［6］李天煜，陳利生.結直腸癌的免疫逃逸與免疫治療進展［J］.結直腸肛門外科，2008，14(4):288 －291.

［7］劉偉東，趙巧艷，毋永娟.EGFR在結直腸癌組織中表達的意義［J］.腫瘤基礎與臨床，2010，23(6):275 －276.