AQP-1在腎透明細胞癌組織中的表達及臨床意義

李世朋，王朏朏，丁雪貞，李文雅，于 樂，宋 瑩，席守民，2

(1.河南科技大學醫(yī)學院，河南 洛陽471003;2.河南科技大學藥理學與醫(yī)學分子生物學重點實驗室，河南洛陽471003)

腎透明細胞癌是我國常見的惡性腫瘤之一，其癌細胞通過直接蔓延、淋巴轉(zhuǎn)移、血行轉(zhuǎn)移及種植轉(zhuǎn)移等多種方式在體內(nèi)播散，從而影響疾病的預后。水通道蛋白－1(aquaporin-1，AQP-1)是對水專一的通道蛋白，其所介導的自由水快速被動地跨生物膜轉(zhuǎn)運是水進出細胞的主要途徑?，F(xiàn)已明確AQP-1是腎臟重吸收水、濃縮尿液，從而維持機體水平衡的主要分子基礎(chǔ)。研究表明，AQP-1在多種腫瘤組織、微血管內(nèi)皮細胞中高表達，其與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關(guān)系［1］。作者采用免疫組化法檢測人腎透明細胞癌組織中AQP-1的表達，旨在探討AQP-1與腎腫瘤的生成、發(fā)展及轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 標本來源 選擇河南科技大學第一附屬醫(yī)院2006年2月至2011年7月接受腎透明細胞癌手術(shù)治療患者術(shù)后存檔的石蠟標本25例，其中男性16例，女性9例;年齡36～73歲。所有患者均經(jīng)常規(guī)病理診斷確診，術(shù)前均未接受化療、放療或免疫治療。隨機選取20例正常腎臟組織存檔石蠟標本作為對照組，其中男性13例，女性7例;年齡34～68歲。所有病例均有完整的臨床資料。

1.2 主要試劑 AQP-1兔抗人多克隆抗體(稀釋濃度1∶200)購自武漢博士德生物工程有限公司 ;DAB顯色試劑盒購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司;免疫組化試劑盒(美國ZYMED公司產(chǎn)品)購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。其他試劑均為分析純。

1.3 方法 每例蠟塊4 μm厚連續(xù)切片5張，其中1張進行HE染色，另4張進行免疫組化染色。采用免疫組化S-P二步法。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水化，蒸餾水沖洗，0.01 mol·L－1枸櫞酸緩沖液微波抗原修復15 min后自然冷卻至室溫，體積分數(shù)3%H2O2室溫孵育10 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性。PBS沖洗2 min×3次;加封閉血清，滴加一抗，4℃過夜，PBS沖洗2 min×3次;滴加生物素標記二抗，37℃孵育30 min;PBS沖洗5 min×3次;DAB顯色，顯微鏡下控制，自來水沖洗終止反應。蘇木素復染2 min，鹽酸乙醇分化，自來水沖洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。以PBS代替一抗作為陰性對照。

1.4 結(jié)果判定 選用試劑盒中的陽性片作為陽性對照，PBS取代一抗作為陰性對照。AQP-1可以表達于細胞膜和(或)細胞質(zhì)，染色呈棕黃色視為陽性。每張切片隨機選擇5個高倍視野，每個高倍鏡視野計數(shù)100個細胞，采用半定量積分法依據(jù)染色強度和陽性細胞百分率判斷染色結(jié)果。按染色強度評分，無著色:0分，淺黃色:1分，棕黃色:2分，棕褐色:3分;按陽性細胞百分率評分，無陽性細胞:0分，＜25%:1分，25%～50%:2分，50% ～75%:3分，＞75%:4分。2項評分之和:0分(－)，1～2分(+)，3～4分(++)，5～7分(+++)。結(jié)果判定采用雙盲法，由2名有經(jīng)驗的臨床病理醫(yī)生確定。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0進行數(shù)據(jù)分析，各組間率的比較采用χ2檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

AQP-1染色主要存在于細胞膜，細胞漿亦有部分染色。在正常腎組織近曲小管上皮細胞的細胞膜和細胞質(zhì)中可見大量棕黃色染色，在毛細血管內(nèi)皮細胞的細胞膜上可見少量棕黃色染色，在腎透明細胞癌的癌細胞中僅見少量的細胞膜著色，而毛細血管內(nèi)皮細胞中可見細胞膜和細胞質(zhì)著色。與正常腎組織相比，腎透明細胞癌組織中AQP-1陽性表達明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);而在腎透明細胞癌組織中毛細血管增生，毛細血管內(nèi)皮AQP-1陽性表達明顯較正常腎臟組織增多，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見圖 1，表 1、2。

表1 AQP-1在不同腎臟組織腎小管中的表達

表2 AQP-1在不同腎組織毛細血管中的表達

3 討論

在腎臟組織中，AQP-1在近曲小管、髓袢降支段的內(nèi)皮細胞都有表達，AQP-1參與了尿液的濃縮并在逆流交換機制上起著重要作用。AQP-1分布廣泛，不僅存在于分泌及吸收型上皮細胞中，而在毛細血管及小血管內(nèi)皮細胞中也很豐富［2］。存在于淋巴管、毛細血管和小靜脈內(nèi)皮中的AQP-1，對于水分迅速進入淋巴管和血管床，調(diào)控細胞間滲透壓和血管內(nèi)的流體靜壓與膠體滲透壓起著平衡的作用。

腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移依賴于血管的生成，為了保持腫瘤細胞無限制的侵襲性生長，腫瘤組織必須依賴持續(xù)的、廣泛的新生血管形成。目前研究證明，AQP-1在血管新生和腫瘤細胞遷移中發(fā)揮著重要的作用［3－6］。在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中，腫瘤細胞增殖快，新陳代謝異?；钴S，對水的需求也增加，因此水通道蛋白對腫瘤細胞的生存非常重要。AQP-1可在多種腫瘤組織、細胞系及腫瘤微血管內(nèi)皮細胞中高度表達，Mobasheri等［7］認為AQP-1在疾病狀態(tài)下改變了新生血管的形成，由此促進了腫瘤組織血管的異常表現(xiàn)，而腫瘤組織血管的生成在其生長、侵襲和轉(zhuǎn)移的過程中起重要作用。

本文應用免疫組化法對AQP-1在腎透明細胞癌組織和正常腎臟組織中的表達進行了檢測，結(jié)果表明，AQP-1在正常腎臟近曲小管上皮細胞呈陽性表達，而在腎透明細胞癌組織中近曲小管遭到破壞，AQP-1表達明顯減少。AQP-1在兩種組織中的表達，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。但腎透明細胞癌組織中毛細血管增生，且毛細血管內(nèi)皮細胞AQP-1表達增多且呈強陽性，同正常腎臟組織的表達相比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。推測AQP-1參與了腫瘤血管內(nèi)皮細胞膜水和離子轉(zhuǎn)運的調(diào)控，促進了血管內(nèi)皮細胞的增殖和遷移，參與了腎透明細胞癌浸潤與轉(zhuǎn)移。AQP-1參與了腎透明細胞癌的發(fā)生、發(fā)展、腫瘤血管生成和轉(zhuǎn)移，并在此過程中起促進作用。

目前對于AQP-1參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)移的研究已有報道，但對AQP-1在腎透明細胞癌中的研究少見，還有許多問題尚未闡明，需進一步的深入研究。

［1］Saadoun S，Papadopoulos MC，Hara-Chikuma M，et al.Impairment of angiogenesis and cell migration by targeted aquaporin-1 gene disruption［J］.Nature，2005，434(7034):786 －792.

［2］Jung JS，Preston GM，Smith BL，et al.Molecular structure of the water channel through aquaporin CHIP.The hourglass mode［J］.J Biol Chem，1994，269(20):14648－14654.

［3］Verkman AS.Aquaporin water channels and endothelial cell function［J］.J Anat，2002，200(3):617 － 627.

［4］Hu J，Verkman AS.Increased migration and metastatic potential of tumor cells expressing aquaporin water channels［J］.FASEB J，2006，10(5):1228 －1236.

［5］Saadoun S，Papadopoulos MC，Davies DC，et al.Increased aquaporin 1 water channel expression in human brain tumours［J］.Br J Cancer，2002，87(6):621 －623.

［6］Vacca A，Ribatti D，Roccaro AM，et al.Bone marrow angiogenesis in patients with active multiple myeloma［J］.Semin Oncol，2001，28(6):543－550.

［7］Mobasheri A，Airley R，Hewitt SM，et al.Heterogeneous expression of the aquaporinl(AQP-1)water channel in tumors of the prostate，breast，ovary，colon and lung:a study using high density multiplehuman tumor tissue mieroarrays［J］.Int J Oncol，2005，26(5):1149－1158.