基于氧化石墨烯淬滅效應的DNA傳感器特異性檢測三聚氰胺

李 靜 裴 昊 李 凡 王麗華 樊春海

（中國科學院上海應用物理研究所 上海 201800）

三聚氰胺(C3H6N6, Melamine, Mel)是廣泛應用于塑料工程和農業的原料。近年來，三聚氰胺在食品中的違規添加造成嚴重后果，引起人們的普遍關注[1,2]。C3H6N6是含氮量很高的三嗪類雜環化合物，每1 kg牛奶中添加0.1 g三聚氰胺，就能提高0.4%的蛋白質含量。常規的凱氏定氮法等全氮測定法無法檢測出三聚氰胺，故曾在牛奶和奶粉里過度添加[3,4]。三聚氰胺進入體內會損害生殖、泌尿系統，如膀胱、腎部結石，并可進一步誘發膀胱癌。現有檢測方法如氣質聯用(GC-MS)、高效液相色譜(HPLC)、表面增強拉曼光譜(SERS)、液相色譜串聯質譜(LC-MS/ MS)等有較高靈敏度，但它們均系大型精密儀器、對實驗環境及操作人員要求較高、檢測時間過長，限制了它們在實際檢測中的應用[5–7]。

本文提出一種快速檢測方法，其基于氧化石墨烯(graphene oxide, GO)的淬滅效應。GO是新型的納米材料，其獨特的物理化學和光學性質，在生物傳感方面的應用十分廣泛[8–10]。研究表明，GO可吸附單鏈DNA形成GO-DNA復合物，并有效淬滅DNA標記染料(如 Fam)的熒光[11–13]。基于三聚氰胺中六元環的平面結構，推測它可與GO表面發生較強作用。三聚氰胺的加入導致其與DNA在GO表面發生競爭，DNA從GO表面脫落進入溶液中，熒光得以恢復。具體為選擇一段長度為15 bp、Fam標記的單鏈DNA序列，通過與GO的吸附形成GO-DNA復合探針，此時Fam-DNA的熒光被有效淬滅。加入三聚氰胺后，熒光得到恢復。圖1為GO-DNA傳感器檢測三聚氰胺示意圖。

圖1 基于GO/Fam-DNA的傳感器檢測三聚氰胺Fig.1 The principle of Melamine detection with the GO/Fam-DNA sensor.

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器

三聚氰胺溶液的配制：取21 mg粉末溶于1 mL 20%的甲醇/水溶液中，終濃度為 167 mmol/L；Fam-DNA 序列為 Fam-TGCGAACCAGGAATT(上海英濰捷基貿易有限公司，HPLC純化)，用Milli Q水制成10 μmol/L的母液備用；GO依據文獻[14–16]合成；1×PBS、麥芽糖、葡萄糖、果糖(上海生工生物工程有限公司)；F-4500熒光分光光度計(Hitachi，日本)；熒光比色皿(宜興市玻璃器皿廠)。

1.2 驗證氧化石墨烯與Fam-DNA的相互作用

取5 μL濃度為10 μmol/L的Fam-DNA，置于995 μL 的 1×PBS 緩沖液(100 mmol/L NaCl，10 mmol/L PB，pH 7.4)中混勻，將比色皿放入熒光分光光度計中，設置參數為激發波長為494 nm，發射波長范圍為504–650 nm[17–20]，電壓為950 V，狹縫寬度為5 nm，記錄Fam-DNA(終濃度50 nmol/L)的熒光光譜。然后向比色皿中加入 5 μL GO(0.47 mg/mL)，混勻后再次記錄熒光光譜。通過比較加入GO前后熒光光譜的變化，驗證GO與Fam-DNA之間的相互作用以及GO-DNA復合物是否形成。

1.3 三聚氰胺的特異性和靈敏度研究

在含有50 nmol/L Fam-DNA、5 μL GO的1 mL溶液中，加入不同體積的三聚氰胺(167 mmol/L)，并使終濃度分別為0、0.0668、0.668、1.34、2.00、3.34、4.66、6.68、10.02、13.36、20.04 mmol/L，記錄熒光光譜，考察三聚氰胺的的檢測范圍和檢測限。在特異性分析中，選擇了0.0668 mmol/L三聚氰胺和10 mmol/L的葡萄糖、麥芽糖、果糖進行分析，考察其特異性。

2 結果

2.1 GO-DNA傳感器檢測三聚氰胺

圖2為DNA、GO-DNA以及GO-DNA/Mel的熒光光譜圖。

圖2 DNA、GO-DNA以及GO-DNA/Mel的熒光光譜圖Fig.2 The fluorescence spectra of DNA, GO-DNA and GO-DNA/Mel.

50 nmol/L Fam-DNA的熒光光譜圖在波長525 nm處熒光值為2431(■)。此時，加入三聚氰胺，熒光值略升高，變化不大(★)。當加入5 μL GO(0.47 mg/mL)后，熒光值迅速下降至103(●)，淬滅效率達95.8%。結果說明，Fam-DNA被吸附到GO表面，并拉近了Fam與GO的距離，導致熒光被GO有效淬滅，該現象與文獻[21–23]報道一致。而加入13.36 mmol/L三聚氰胺后，三聚氰胺將 GO表面的Fam-DNA 取代，熒光值重新升至 1685(▲)，上升16.4倍。該數據有效地證實了當GO與Fam-DNA距離較近時，GO可以淬滅Fam-DNA熒光，使熒光值迅速下降；而三聚氰胺能夠取代 GO表面的Fam-DNA，使Fam-DNA與GO距離變大，熒光值升高；所以，通過熒光值的變化可以檢測三聚氰胺，即用GO-DNA傳感器檢測三聚氰胺的方法可行。

2.2 三聚氰胺檢測的特異性和靈敏度分析

為證明三聚氰胺檢測方法的特異性，我們進行了空白分析和對照分析，對三聚氰胺、三種對照樣品及空白對照結果見圖3，其縱坐標為加入樣品前后的熒光增加值ΔF=F–F0。由圖3可見，10 mmol/L麥芽糖(Mal)、葡萄糖(Glu)和果糖(Fru)的加入導致熒光值有小幅升高，說明它們與GO的相互作用較弱，只有少量的DNA分子從GO表面脫落。而0.0668 mmol/L三聚氰胺的加入導致熒光值升高了143，信噪比為10左右，表明三聚氰胺與GO表面存在著強相互作用。這種GO與三聚氰胺的獨特作用，很易區分三聚氰胺與其它分析物，實現特異性檢測。

圖3 GO-DNA傳感器特異性檢測三聚氰胺Fig.3 Selectivity of melamine detection by the GO-DNA sensor.

圖4給出了基于GO/Fam-DNA的傳感器在檢測不同濃度三聚氰胺的熒光變化情況。在含有Fam-DNA和GO的檢測體系中，加入不同濃度的三聚氰胺(0、0.0668、0.668、1.34、2.00、3.34、4.68、6.68、10.02、13.36、20.04 mmol/L)。由圖4(a)，熒光值隨三聚氰胺濃度而升高，到13.36 mmol/L時達到最高。對熒光值與三聚氰胺濃度進一步進行分析，三聚氰胺的線性檢測范圍為0.0668–1.336 mmol/L，最低檢測到 6.68×10–5mol/ L 三聚氰胺(圖4b)。檢測三聚氰胺的其它方法檢測限：ELISA(免疫檢測法)最低檢測限為1 μg/mL，但復雜，檢測時間長，不如本方法簡便、快速。

綜上所述，利用 GO-DNA傳感器檢測三聚氰胺，具有很好的特異性和靈敏度，整個檢測過程簡便快速，適合大批量樣品的現場分析。

圖4 基于GO-DNA的傳感器檢測不同濃度三聚氰胺Fig.4 GO-DNA based sensor for detection of various concentrations of melamine.

3 結語

“三鹿奶粉事件”等類似事件的發生對三聚氰胺的檢測提出了更高的要求[18]。本工作提出了一種基于GO-DNA的檢測方法，并實現了三聚氰胺的快速、靈敏檢測。該方法主要是基于GO與Fam-DNA、三聚氰胺的相互作用差異，并通過 DNA和三聚氰胺在GO表面的競爭吸附來實現三聚氰胺的檢測。與傳統方法相比，基于GO的熒光檢測方法具有以下優點：(1) 操作簡便，對檢測人員技能及檢測環境要求不高；(2) 不需要大型精密儀器，成本低；(3)分析時間短，可以快速得到實驗結果；(4) 特異性高，可以特異性檢測三聚氰胺，因此檢測樣品不需要復雜的前處理，可以直接檢測，節省分析時間；(5) 靈敏度較好，可以檢測 0.0668 mmol/L三聚氰胺；(6) 檢測精確度高，重復性好；(7) 實用性好，該方法可用于實際樣品的檢測。 因此，GO-DNA傳感器可以快速、準確、特異地檢測三聚氰胺，是一種有效檢測三聚氰胺的新方法。

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