羅非魚(yú)魚(yú)鱗粉直接酶解制備膠原蛋白的工藝研究

孫憲迅，孫齊英，韓 雪，周理紅

（江漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢430056）

膠原蛋白在食品、醫(yī)藥、美容等領(lǐng)域的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，年增長(zhǎng)率達(dá)到15%[1～5］。傳統(tǒng)的膠原蛋白制備方法是以豬、牛等陸生動(dòng)物的皮和骨頭為原料進(jìn)行提取的。近年由于瘋牛病和口蹄疫等疾病的發(fā)生，使膠原蛋白的原料安全性受到質(zhì)疑。

羅非魚(yú)耐低氧，易養(yǎng)殖，在海水、淡水中均可養(yǎng)殖，已被視為傳統(tǒng)魚(yú)類(lèi)的替代品種，是世界性的主要養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)[6，7］。我國(guó)養(yǎng)殖羅非魚(yú)產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的50%以上，加工產(chǎn)生的羅非魚(yú)魚(yú)鱗逐年增加[8］。魚(yú)鱗中含有50%～70%的蛋白質(zhì)，主要為膠原蛋白和角蛋白。從魚(yú)鱗中提取膠原蛋白[6，9～14］，一般是在酶解前用酸、堿浸泡魚(yú)鱗以溶解無(wú)機(jī)鹽，這樣不可避免地產(chǎn)生了一定量的廢水，還造成部分蛋白質(zhì)損失[15～18］。

作者在此將羅非魚(yú)魚(yú)鱗用氣流式超微粉高速粉碎機(jī)粉碎后過(guò)篩，直接用堿性蛋白酶（Alcalase）酶解，酶解液經(jīng)濃縮、干燥，得到膠原蛋白粉。以膠原蛋白提取率為考核指標(biāo)，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)對(duì)酶解條件進(jìn)行了優(yōu)化。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

羅非魚(yú)魚(yú)鱗，購(gòu)自海南水產(chǎn)品市場(chǎng)。

堿性蛋白酶（2.4AU·g－1），諾維信（中國(guó)）公司。

RT－25小型氣流式超微粉高速粉碎機(jī)，紫外分光光度計(jì)，ZFQ 85－A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，LGL 05－2型真空冷凍干燥機(jī)。

1.2 工藝流程

羅非魚(yú)魚(yú)鱗→干燥→粉碎→過(guò)篩→Alcalase酶解→滅酶→過(guò)濾→取上清液→冷凍干燥→膠原蛋白粉

1.3 羅非魚(yú)魚(yú)鱗粉碎度對(duì)膠原蛋白提取的影響

稱(chēng)取50g羅非魚(yú)魚(yú)鱗，用氣流式超微粉高速粉碎機(jī)粉碎后，分別用400目、300目、200目、160目、120目、100目、80目、60目的篩子過(guò)篩分級(jí)，各取1g羅非魚(yú)鱗粉，使魚(yú)鱗粉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7%，測(cè)定魚(yú)鱗粉碎度對(duì)膠原蛋白提取的影響。

1.4 單因素實(shí)驗(yàn)

取粉碎度≥100目的魚(yú)鱗粉，分別考察羅非魚(yú)魚(yú)鱗粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)（3%、5%、7%、9%、11%、13%）、酶解溫度（50℃、55℃、60℃、65℃、70℃）、酶解pH 值（7.0、8.0、9.0、10.0、11.0）、酶加量（0.02AU·g－1、0.04AU·g－1、0.06AU·g－1、0.08AU·g－1、0.10 AU·g－1）、酶解時(shí)間（0.5h、1.0h、2.0h、3.0h）對(duì)膠原蛋白提取率的影響。除所研究因素外，其它各因素取基本值（酶解溫度60℃ ，酶解pH值9.0，羅非魚(yú)魚(yú)鱗粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)7%，酶加量0.04AU·g－1，酶解時(shí)間2.0h）。

1.5 正交實(shí)驗(yàn)

參照文獻(xiàn)[10，12，16］，選擇酶解溫度、酶解 pH 值、酶加量、酶解時(shí)間為考察因素，以膠原蛋白提取率為考核指標(biāo)，進(jìn)行L9（34）正交實(shí)驗(yàn)，以?xún)?yōu)化酶解條件。正交實(shí)驗(yàn)的因素與水平見(jiàn)表1 。

表1 正交實(shí)驗(yàn)的因素與水平Tab.1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.6 膠原蛋白提取率的測(cè)定

用凱氏定氮法分別測(cè)定膠原蛋白粉和原料中的氮含量，按下式計(jì)算膠原蛋白提取率。

2 結(jié)果與討論

2.1 魚(yú)鱗粉碎度對(duì)膠原蛋白提取率的影響（圖1）

圖1 魚(yú)鱗粉碎度對(duì)膠原蛋白提取率的影響Fig.1 Effect of mesh of tilapia scale powder on extraction rate of collagen

由圖1可知，膠原蛋白提取率隨魚(yú)鱗粉目數(shù)的增大而升高。在60～100目，膠原蛋白提取率迅速升高；在100～400目，膠原蛋白提取率緩慢升高。這是因?yàn)椋~(yú)鱗粉碎后，破壞了魚(yú)鱗中膠原蛋白的主要保護(hù)組織羥基磷灰石的晶體結(jié)構(gòu)，使膠原蛋白能與酶接觸，充分酶解，當(dāng)粉碎度較大時(shí)，魚(yú)鱗粉顆粒越小，比表面積越大，酶吸附在魚(yú)鱗粉末的機(jī)會(huì)越多，反應(yīng)越徹底，膠原蛋白提取率越高；當(dāng)粉碎度較小時(shí)，魚(yú)鱗粉顆粒越大，酶與魚(yú)鱗接觸的面積越小，顆粒內(nèi)部的膠原蛋白不易與酶接觸，造成酶解效率低。考慮到加工成本，選用魚(yú)鱗粉碎度為100目。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 羅非魚(yú)魚(yú)鱗粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)膠原蛋白提取率的影響（圖2）

由圖2可知，膠原蛋白提取率隨羅非魚(yú)魚(yú)鱗粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而降低，當(dāng)羅非魚(yú)魚(yú)鱗粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)從3%增加到7%時(shí)，膠原蛋白提取率緩慢降低；當(dāng)羅非魚(yú)魚(yú)鱗粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)從7%增加到9%時(shí)，膠原蛋白提取率迅速降低；之后，降幅趨緩。這是因?yàn)椋黾恿_非魚(yú)魚(yú)鱗粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)，酶解液粘度增大，影響酶與羅非魚(yú)魚(yú)鱗粉結(jié)合，酶解效果差，提取率下降；羅非魚(yú)魚(yú)鱗粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)較小時(shí)，酶解效果較好，膠原蛋白提取率較高。考慮到下游的過(guò)濾與干燥成本，選擇羅非魚(yú)魚(yú)鱗粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7%。

圖2 羅非魚(yú)魚(yú)鱗粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)膠原蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of mass fraction of tilapia scale powder on extraction rate of collagen

2.2.2 酶解溫度對(duì)膠原蛋白提取率的影響（圖3）

圖3 酶解溫度對(duì)膠原蛋白提取率的影響Fig.3 Effect of enzymolysis temperature on extraction rate of collagen

由圖3可知，膠原蛋白提取率隨酶解溫度的升高先升高后降低，在酶解溫度為60℃時(shí)達(dá)到最高。這是因?yàn)椋邷厥咕S持酶分子結(jié)構(gòu)的次級(jí)鍵解體，導(dǎo)致酶蛋白變性，從而使得酶活性減弱或喪失。因此，選擇酶解溫度為60℃。

2.2.3 酶解pH值對(duì)膠原蛋白提取率的影響（圖4）

由圖4可知，膠原蛋白提取率隨酶解pH值的增大先升高后降低，在酶解pH值為9.0時(shí)達(dá)到最高。因此，選擇酶解pH值為9.0。

2.2.4 酶加量對(duì)膠原蛋白提取率的影響（圖5）

由圖5可知，膠原蛋白提取率隨酶加量的增大先升高后降低，在酶加量為0.06AU·g－1時(shí)，膠原蛋白提取率較高，但與酶加量為0.04AU·g－1相比升幅很小。因此，選擇酶加量為0.04AU·g－1。

2.2.5 酶解時(shí)間對(duì)膠原蛋白提取率的影響（圖6）

圖6 酶解時(shí)間對(duì)膠原蛋白提取率的影響Fig.6 Effect of enzymolysis time on extraction rate of collagen

由圖6可知，酶解0.5～2.0h內(nèi)，膠原蛋白提取率迅度升高；之后，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，膠原蛋白提取率升幅不明顯。這是因?yàn)椋?.0h以后，提取液中蛋白質(zhì)濃度高，粘性大，阻止了酶與底物的進(jìn)一步接觸和膠原蛋白的溶出，即使繼續(xù)延長(zhǎng)酶解時(shí)間，上清液中的膠原蛋白含量也不會(huì)明顯升高。綜合考慮，選擇酶解時(shí)間為2.0h。

2.3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析（表2 ）

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析Tab.2 Results and analysis of orthogonal experiment

由表2 可知，各因素對(duì)膠原蛋白提取率的影響大小依次為A＞D＞C＞B，即酶解溫度＞酶解時(shí)間＞酶加量＞酶解pH值。堿性蛋白酶酶解羅非魚(yú)魚(yú)鱗制備膠原蛋白的最優(yōu)水平組合為A3B1C3D2，即最佳酶解條件為：酶解溫度65℃、酶解pH值8.5、酶加量0.05 AU·g－1、酶解時(shí)間2.0h。

在上述最佳酶解條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，膠原蛋白提取率達(dá)95.79%。

3 結(jié)論

采用堿性蛋白酶直接酶解羅非魚(yú)魚(yú)鱗制備膠原蛋白，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)，確定最佳酶解條件為：100目羅非魚(yú)魚(yú)鱗粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)7%、酶解溫度65℃、酶解pH值8.5、酶加量0.05AU·g－1、酶解時(shí)間2.0h，在此條件下，膠原蛋白提取率達(dá)95.79%。該方法具有產(chǎn)率高、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，適于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。

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