熒光猝滅法研究Mn（Ⅱ）和Zn（Ⅱ）與牛血清白蛋白的結合競爭

李 艷，彭艷紅

（湖北科技學院核技術與化學生物學院，湖北 咸寧437100）

蛋白質是細胞內重要的生物大分子、功能分子，具有運載和儲存功能[1～3］。血清白蛋白是血漿中含量最豐富的重要載體蛋白，藥物進入血漿后，首先與血清白蛋白結合，然后再被運送到身體的各部位發揮藥效[4～6］。各種金屬離子進入人體一般需要通過血漿的儲存和運輸到達受體部位，產生藥理作用。研究金屬離子與血清白蛋白的相互作用，對了解金屬離子的作用機制具有重要意義。熒光法研究金屬離子與蛋白質的結合，靈敏度高、選擇性好、操作簡便易行，是應用最普遍的研究手段之一。

Zn與Mn都是人體必需的元素。Zn能構成一些酶的活性部位，催化多種化合物的水解、水合和脫羧等反應[7］；若缺少 Mn會使人智力低下、發育不良[8］。作者在此首先采用熒光猝滅法研究Mn（Ⅱ）與牛血清白蛋白（BSA）的結合作用，在此基礎上進一步研究 Mn（Ⅱ）和Zn（Ⅱ）與BSA的結合競爭。

1 實驗

1.1 試劑與儀器

牛血清白蛋白（BSA），分子量68 000，華美公司；Tris－Base（生化試劑）；氯化錳、氯化鋅、鹽酸、氯化鈉等均為分析純；實驗用水為二次蒸餾水。

帶恒溫系統的F－4500型熒光光度計，日本日立公司；PHS－3C型數字式酸度計，上海今邁儀器儀表公司；AYU120型分析天平，日本島津公司。

1.2 方法

1.2.1 溶液的配制

配制不同溫度（T＝298K、302K、306K、310K）下pH＝7.4的Tris－HCl緩沖溶液；在2cm的比色皿中分別加入2mL 1×10－5mo1·L－1的BSA溶液和不同量的Mn（Ⅱ）溶液，得不同比例（物質的量之比）的Mn（Ⅱ）－BSA系列溶液。同法配制不同比例的Zn（Ⅱ）－BSA 系列溶液、不同比例的 Mn（Ⅱ）－BSA－Zn（Ⅱ）系列溶液。

1.2.2 熒光光譜的測定

（1）Mn（Ⅱ）－BSA體系的熒光光譜測定：選定激發和發射狹縫均為5.0nm，激發波長為295nm，在300～500nm波長范圍內掃描并繪制不同濃度Mn（Ⅱ）對BSA的熒光猝滅光譜；固定△λ＝15nm或△λ＝60nm，在一定波長范圍內掃描BSA和 Mn（Ⅱ）－BSA體系，記錄Mn（Ⅱ）作用于BSA的同步熒光光譜（測定溫度為298K）。

（2）Mn（Ⅱ）－BSA－Zn（Ⅱ）體系的熒光光譜測定：選定激發和發射狹縫均為5.0nm，激發波長為295nm，在300～500nm波長范圍內掃描并繪制不同比例Zn（Ⅱ）－BSA和 Mn（Ⅱ）－BSA－Zn（Ⅱ）的熒光猝滅光譜。

2 結果與討論

2.1 Mn（Ⅱ）對BSA的熒光猝滅特征

BSA是內源性熒光物質，其分子中的色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸（Phe）等芳香性氨基酸殘基能夠發射熒光。色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸因發色團不同而有著不同的熒光光譜，其最大的熒光發射峰分別位于340nm、305nm和282nm，其中色氨酸的熒光強度最大、苯丙氨酸的最小。故BSA的內源熒光主要來自于色氨酸和酪氨酸。

本實驗以295nm作為體系的激發波長，是為了降低酪氨酸和苯丙氨酸的影響，從而使牛血清白蛋白的熒光主要來自色氨酸殘基。

固定BSA的量，考察Mn（Ⅱ）對BSA熒光光譜的影響，結果如圖1所示。

圖1 Mn（Ⅱ）對BSA熒光光譜的影響Fig.1 Quenching of BSA fluorescence spectra by adding Mn（Ⅱ）

由圖1可知，隨著Mn（Ⅱ）濃度的增大，BSA的最大熒光峰位置不變，但熒光強度卻降低。說明Mn（Ⅱ）與BSA的結合較強。

2.2 熒光猝滅機理的確定

熒光猝滅通常分為動態猝滅和靜態猝滅兩種，動態猝滅是猝滅劑分子和熒光物質的激發態分子之間的相互作用引起的，猝滅常數隨溫度的升高而增大；靜態猝滅是猝滅劑分子與熒光物質分子在基態時生成不發光的配合物引起的，猝滅常數隨溫度的升高而減小。在動態猝滅過程中，猝滅劑和熒光物質之間的相互作用遵循 Stern－Volmer方程[9］。即：

式中：F0和F分別表示不存在和存在猝滅劑時熒光物質的熒光強度；[Q］為猝滅劑的濃度，mol·L－1；KSV為Stern－Volmer猝滅常數，L·mol－1。

分別測定不同溫度（T＝298K、302K、306K、310 K）下，Mn（Ⅱ）對BSA的熒光猝滅情況，繪制（F0／F）－1～[Q］曲線，如圖2所示。

由圖2可知，Mn（Ⅱ）對BSA熒光猝滅的Stern－Volmer曲線具有良好的線性關系。表明Mn（Ⅱ）對BSA的熒光猝滅符合動態猝滅機理。

按式（1）計算出不同溫度下的KSV，結果見表1 。

表1 pH＝7.4時，不同溫度下 Mn（Ⅱ）－BSA體系的KSV、ΔGθ、ΔHθ、ΔSθ、Kb、n，R，SDTab.1 With pH＝7.4，the KSV，ΔGθ，ΔHθ，ΔSθ，Kb，n，R，SD for Mn（Ⅱ）－BSA system at different temperatures

由表1 可知，Mn（Ⅱ）對BSA的猝滅常數隨著溫度的升高而增大，這進一步說明了Mn（Ⅱ）對BSA的熒光猝滅屬于動態猝滅。

2.3 作用力類型的確定

有機小分子與蛋白質等生物大分子之間的結合力主要有疏水作用力、氫鍵、范德華力和靜電引力。若ΔH＞0、ΔS＞0，為疏水作用力；若ΔH＜0、ΔS＜0，為氫鍵和范德華力；若ΔH≈0、ΔS＞0，為靜電引力。

假設在測定溫度范圍內焓變變化不大，則它的焓變ΔH和熵變△S可以從Vant－Hoff方程求得：

式中K類似于相應溫度下Stern－Volmer方程中的猝滅常數KSV。

自由能變△G由下式求得：

以lnK對1／T作圖，如圖3所示。

圖3 Vant－Hoff曲線Fig.3 Vant－Hoff Plot

根據 Vant－Hoff曲線及式（3）計算出 Mn（Ⅱ）與BSA相互作用的有關熱力學參數 ΔGθ、ΔHθ、ΔSθ的值，見表1 。

由表1 可知，該反應ΔG＜0，表明反應是自發進行的；同時TΔSθ＞ΔHθ，表明 Mn（Ⅱ）與BSA的結合主要是熵驅動；ΔH＞0、ΔS＞0，表明 Mn（Ⅱ）與BSA之間的作用力主要為疏水作用力。

2.4 表觀結合常數及結合位點數的計算

當小分子與大分子結合時其表觀結合常數與結合位點數由下式求出：

式中：n為結合位點數；Kb為表觀結合常數[10］。

繪制不同溫度下的lg[（F0／F）－1］～lg[Q］曲線，如圖4所示。

圖4 lg[（F0／F）－1］～lg[Q］曲線Fig.4 lg[（F0／F）－1］～lg[Q］Plots

依lg[（F0／F）－1］～lg[Q］直線的斜率和截距即可求出Mn（Ⅱ）與BSA的結合位點數n及表觀結合常數Kb，結果見表1 。

由表1 可知，在298K、302K、306K、310K時，相關系數R大于0.99，結合位點數約為1，說明 Mn（Ⅱ）與BSA之間有較強的結合作用，可以被蛋白質所儲存和運輸。

2.5 Mn（Ⅱ）對BSA構象的影響

△λ＝15nm和△λ＝60nm所得到的同步熒光光譜分別顯示蛋白質酪氨酸殘基和色氨酸殘基的熒光光譜特征。因氨基酸殘基的最大發射波長與其所處環境的極性有關，故由發射波長的改變可判斷BSA構象變化。

固定BSA濃度，逐漸增大Mn（Ⅱ）的濃度，記錄△λ＝15nm和△λ＝60nm時BSA的同步熒光光譜，結果如圖5所示。

圖5 △λ＝15nm（a）和△λ＝60nm（b）時，BSA的同步熒光光譜Fig.5 Synchronous fluorescence spectra of BSA atΔλ＝15nm（a）andΔλ＝60nm（b）in the presence of Mn（Ⅱ）

由圖5可知，BSA的熒光主要由色氨酸殘基貢獻，Mn（Ⅱ）的加入并未改變BSA的構象。

2.6 Zn（Ⅱ）對BSA的熒光猝滅特征

按照測定Mn（Ⅱ）的方法測定Zn（Ⅱ）與BSA的相互作用。固定BSA體積，逐漸加入一定濃度的Zn（Ⅱ），測其熒光強度。結果表明，Zn（Ⅱ）濃度對BSA的熒光強度影響非常小，可知Zn（Ⅱ）不會對BSA產生熒光猝滅。

2.7 Mn（Ⅱ）－BSA－Zn（Ⅱ）的熒光猝滅特征

考察Mn（Ⅱ）、Zn（Ⅱ）對BSA熒光光譜的影響，結果見圖6。

圖6 Mn（Ⅱ）和Zn（Ⅱ）對BSA熒光光譜的影響Fig.6 Quenching of BSA fluorescence spectra by adding Mn（Ⅱ）and Zn（Ⅱ）

由圖6可知，雙金屬體系會對BSA熒光光譜產生猝滅效應；隨著金屬離子濃度的增大，熒光強度降低，但BSA的最大熒光峰位置不變。與Mn（Ⅱ）對BSA的影響比較，雙金屬離子的影響要小很多，因為Zn（Ⅱ）不會對BSA產生猝滅效應，說明Zn（Ⅱ）的加入會競爭Mn（Ⅱ）與BSA的結合。

2.8 Zn（Ⅱ）和 Mn（Ⅱ）與BSA的結合競爭的討論

2.8.1 單金屬體系與雙金屬體系的KSV分析

在298K、pH＝7.4的條件下分別測定 Mn（Ⅱ）－BSA體系與 Mn（Ⅱ）－BSA－Zn（Ⅱ）體系的熒光猝滅光譜，按式（1）計算出 Mn（Ⅱ）－BSA單金屬體系和 Mn（Ⅱ）－BSA－Zn（Ⅱ）雙金屬體系的 KSV分別為0.1025×104L·mol－1、0.0498×104L·mol－1，雙金屬體系的KSV小于 Mn（Ⅱ）－BSA單金屬體系。說明Zn（Ⅱ）會對Mn（Ⅱ）與BSA的結合產生競爭。

2.8.2 單金屬體系與雙金屬體系的KD分析

由Stern－Volmer方程變形可得：

按式（5）求出 Mn（Ⅱ）－BSA 和Zn（Ⅱ）－BSA－Mn（Ⅱ）的離解常數KD分別為3.5×104、1.68×104。可以看出，兩種體系中Mn（Ⅱ）與BSA的結合都較強，但雙金屬體系中Mn（Ⅱ）與BSA的離解常數更小，說明Zn（Ⅱ）會對Mn（Ⅱ）與BSA的結合產生競爭，可能會使剩下的 Mn（Ⅱ）與BSA結合更穩定，不容易離解。

3 結論

應用熒光光譜法研究 Mn（Ⅱ）和Zn（Ⅱ）與BSA的結合競爭，結果表明：

（1）Mn（Ⅱ）對BSA的熒光猝滅機理是動態猝滅；

（2）Mn（Ⅱ）與BSA以摩爾比1∶1結合，結合過程主要是熵驅動，相互作用力主要為疏水作用力；

（3）Mn（Ⅱ）在與BSA作用的過程中，主要是BSA的色氨酸發生熒光，Mn（Ⅱ）的加入不會改變BSA的構象；

（4）Zn（Ⅱ）不會對BSA產生熒光猝滅效應；

（5）Zn（Ⅱ）會競爭 Mn（Ⅱ）與BSA 的結合，Zn（Ⅱ）與BSA結合穩定性小于Mn（Ⅱ）與BSA的結合穩定性。

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