復方桑黃顆粒中總黃酮成分提取工藝研究

陳雨微 張紅玉 宋棋芬 徐茂義 黃越燕

嘉興學院醫學院，浙江嘉興 314001

復方桑黃顆粒中總黃酮成分提取工藝研究

陳雨微 張紅玉 宋棋芬 徐茂義 黃越燕▲

嘉興學院醫學院，浙江嘉興 314001

目的優化復方桑黃顆粒的提取工藝。方法 以正交試驗表對復方桑黃顆粒中總黃酮成分醇提工藝的影響因素進行考察，優選工藝條件。 結果 優選提取工藝為20倍量的70%乙醇，回流提取3次，總黃酮提取率為30.29%，出膏率為10.39%。 結論 該提取工藝條件穩定，重現性好，可為復方桑黃顆粒的大生產提供參考依據。

桑葉；總黃酮；提取工藝；正交試驗

復方桑黃顆粒源自臨床驗方，是由桑葉、葛根、黃精、百合制成的復方制劑，具有滋腎潤肺、補脾益氣、除煩止渴之功效?，F代醫學研究證實，桑葉黃酮具有降糖、抗氧化、降血脂、抗動脈粥樣硬化、抗菌、抗病毒等藥理作用[1-2]，葛根素具有降低血管阻力，改善心腦血液循環，降血糖、抗氧化等藥理作用[3]。根據各藥材的有效成分及功能，為最大限度地保留有效成分[4-5]，并依據適當經濟的原則，對桑葉、葛根采取乙醇回流提取總黃酮類成分，對黃精、百合水煎煮提取多糖成分，合并制成復方制劑。為保證制劑質量及臨床療效，本實驗通過正交實驗探討復方桑黃顆粒中總黃酮成分提取工藝，以尋找最佳的提取工藝條件。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

RE-52AA型旋轉蒸發儀（上海亞榮）；SB-5200型超聲清洗儀（上海必能信）；GM-0.33II型隔膜式真空泵（天津騰達）；UV-210型紫外分光光度計（日本島津）；BS110S型電子分析天平（北京賽多利斯）；DZF-6050型真空干燥箱（上海精宏）。

1.2 試藥

蘆丁對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：100080-200708）；桑葉、葛根、黃精、百合，購于嘉興嘉信醫藥股份有限公司，經鑒定符合《中國藥典》2010年版有關規定。乙醇、丙酮、氯仿、甲醇等試劑為分析純，乳糖、可溶性淀粉、糊精等為藥用輔料。

1.3 統計學處理

應用SPSS17.0統計軟件對樣本率進行x2檢驗和Spearman相關系數分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 方法與結果

2.1 正交設計

通過預實驗得知影響提取的主要因素為乙醇濃度（A）、乙醇用量（B）、提取時間（C）、提取次數（D），為進一步優選各因素最佳工藝水平，設計正交試驗，考慮到復方多成分作用的特點及方中黃酮類化合物的生物特性，選擇浸膏得率與總黃酮提取率為綜合評價指標，采用L9（34）正交表優選醇提的最佳工藝條件，因素水平設計見表1，平行重復3次實驗（n=3）。

表1 正交試驗因素水平設計

2.2 實驗方法及結果

藥材烘干至恒重，粉碎過12目篩，按復方桑黃顆粒處方比例精密稱取桑葉、葛根共20 g，共計9份，按表1條件進行試驗。即用相應溶劑密閉浸漬30 min，于70℃水浴條件下乙醇回流提取，提取液合并過濾，濾液于4 ℃冷藏2 h后減壓回收乙醇至無醇味，水浴濃縮，抽濾，濾液定容于100 mL，搖勻，得1～9號樣品，待測。平行操作3遍，共計27份樣品，按“2.2.1”和“2.2.2”項目下操作，測定總黃酮提取率和浸膏得率，并充分考慮二者關系及對真實結果的影響，利用總黃酮平均提取率+浸膏平均得率作為綜合加權評分，得出綜合評分，結果見表2。為進一步確定各因素對結果的影響大小，對試驗結果進行了方差分析，結果見表3。

2.2.1 浸膏得率的測定 精密量取50 mL的桑葉葛根提取液，置于潔凈干燥并已稱重的蒸發皿中，水浴蒸干，置于烘箱內105℃干燥3 h，于干燥器內冷卻30 min，迅速精密稱定質量，計算浸膏得率，記錄3次平均值。浸膏得率=干膏質量/藥材重×100 %。結果見表2。

2.2.2 總黃酮含量的測定 （1）對照品溶液的制備：精密稱取蘆丁標準品10.5 mg，加70%乙醇適量使溶解，定容于50 mL容量瓶中，搖勻，得對照品儲備液。（2）標準曲線的繪制：精密量取對照品儲備液 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0 mL于25 mL容量瓶中，補加70%乙醇至6 mL，加入5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻后放置6 min，加入10%硝酸鋁溶液 1 mL，搖勻后放置6 min，加入4 %氫氧化鈉溶液10 mL，用70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，得蘆丁對照品溶液。以0 mL蘆丁對照品溶液作空白，在360～600 nm波長范圍測定吸光度，選擇吸光度最大的500 nm處，測定其吸光度。以吸光度值（Y）為縱坐標，濃度（X）為橫坐標繪制標準曲線，計算回歸方程，得Y=0.093 1X-0.002 3（r= 0.996 7）。（3）供試品溶液的測定：量取少量樣品液以0.45 μm微孔濾膜過濾，精密吸取50 μl濾液置于25 mL容量瓶中，加入70%乙醇6 mL，按照“2.2.2.2下”加入5 %亞硝酸鈉起相同操作，制得供試品待測液，于500 nm處測定供試品中總黃酮的含量，計算總黃酮平均提取率。結果見表2。

表2 正交試驗結果

表3 方差分析結果

從上述結果分析可以看出，各因素的影響大小依次為：B＞D＞A＞C。由表3結果可見，B，D兩因素對顆粒劑的綜合評分差異極顯著，A因素呈顯著性差異，而C因素在考察范圍內的影響很小。從省時降耗及生產實際出發，在保證提取充分的前提下，綜合分析各個因素對總黃酮的提取率和浸膏得率的影響，擬定最佳工藝為：20倍乙醇用量，提取3次，乙醇濃度60%，每次提取2 h。

表4 最佳工藝條件驗證結果

2.2.3 驗證性試驗 按照正交試驗確定的最佳工藝條件下，進行驗證試驗，重復3次，結果見表4。測定浸膏平均得率為10.39%，總黃酮平均提取率為30.29%，均高于正交實驗的其余各組數據，證明優選工藝數據可靠。

3 討論

隨著我國人口老年化和人均生活水平的提高，糖尿病的發病人群和高危人群群體越來越大，中醫藥在治療糖尿病方面也越來越受重視。復方桑黃顆粒由4味藥材組方：桑葉、葛根、黃精、百合均列入我國衛生部公布的藥食同源名錄。原方為湯劑，改制成顆粒劑后，既省去了湯劑臨用時煎煮的麻煩，又克服了湯劑貯存、攜帶、服用不便的缺點，更適合現代人的用藥需求。

桑葉與葛根是本復方制劑處方中的重要藥物，其降血糖的主要成分均為黃酮類化合物，因此選擇總黃酮作為其乙醇提取工藝階段的主要考察評價指標。本試驗根據各藥材的理化性質并結合預實驗結果，篩選符合工藝實際的多個指標進行試驗，采用綜合權重評分法結合正交設計優化制備工藝，因此較單指標分析的傳統方法更全面、科學、實用。方差分析結果顯示，影響提取極其顯著的因素是乙醇用量、提取次數，較顯著的因素為乙醇濃度，提取時間為不顯著因素。經過直觀分析和方差分析，結果一致，說明本研究方法合理，數據可靠，結果可信。

本研究重點討論復方桑黃顆粒中總黃酮成分的提取工藝，對于本處方的制備工藝中，多糖類化合物的提取工藝條件的優化另行研究及報道。

[1]原愛紅，馬駿，蔣曉峰.桑葉中糖苷酶抑制活性組分的篩選[J].中國中藥雜志，2006，2（3）：223-227.

[2]萬利秀，肖更生，劉亮 .桑葉中黃酮的研究進展 [J].廣東蠶業，2009，3（30）：44-48.

[3]李健.葛根總黃酮的研究進展[J].安徽醫藥，2008，12（12）：1117-1118.

[4]劉利，潘一樂.春秋桑葉總黃酮含量分析及提取工藝優化[J].食品科學，2009，30（4）：72-75.

[5]甘琳，周芳，張越非，等.葛根總黃酮提取工藝比較[J].時珍國醫國藥，2010，21（4）：929-931.

Studies on extraction of total flavonoids of compound Sanghuang granules

CHEN Yuwei ZHANG Hongyu SONG Qifen XU Maoyi HUANG Yueyan
Medical College of Jiaxing Universtity,Jiaxing 314001,China

Objective To optimize the extraction process for compound sanghuang granules.Methods Factors affecting the ethanol extraction process to flavonoids of compound sanghuang granules was studied,the best preparation technological conditions was screened by orthogonal design.Results The optimal extraction technique conditions were as follows:20 times of amount of 70% alcohol,extracted for 3 times,each time for 2 hours.High yield of extractum (30.29%) and high content of flavonids (10.39%) are obtained with the present technology.Conclusion The extracting method are stables and replicable,which can provide reference for preparation of compound sanghuang granules.

Mulberry;Flavonoids;Extraction technology;Orthogonal test

R284.2

A

2095-0616（2012）03-152-02

浙江省嘉興市科技局資助項目（2010AY1066）；2010年度浙江省大學生科技創新活動計劃資助項目（2010R417005）。

▲通訊作者

2011-12-23）